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石榴(Punica granatum L.)为石榴科石榴属落叶灌木或小乔木植物,原产印度、伊朗、阿富汗等中亚地区,距今已有五千多年的栽培历史,引入中国至今已有2000余年的栽培历史。石榴在我国经长期天然杂交和基因突变,以及采用实生、分株、嫁接等多种繁殖方法,产生了复杂多样的品种和类型,据不完全统计,我国现有石榴品种资源约238个,分布遍及南北各地20多个省区。目前,国际上还没有建立统一的石榴品种分类方法和分类体系,大都根据果树学、农艺性状进行分类、鉴定,而且各地研究者对石榴品种资源进行调查研究时,都局限于某一地区,从不同的角度对石榴品种进行分类,导致品种混杂、同种异名、同名异种的现象出现,绝大多数品种的系统演化和品种间的亲缘关系也无文献资料可考证,给准确进行品种资源鉴定和利用带来了困难。本研究旨在应用ISSR标记技术对中国部分石榴品种进行遗传多样性、亲缘关系分析；应用AFLP标记技术对川滇石榴种质资源的遗传多样性和亲缘关系进行分析,揭示石榴品种的来源及其演变,为更合理地保护、开发石榴资源及进行石榴新品种选育提供遗传信息,为将来石榴种质资源研究和分子系统学研究提供依据。主要研究结果如下：(1)石榴基因组DNA提取：本研究针对石榴叶片富含多酚、多糖等次生物质的特点,对提取DNA的CTAB法进行改良：首先,选用1.5×10-2 mol. L-1 Na2B4O7.10H2O为多酚氧化酶抑制剂,完全抑制酚的氧化,消除多酚类物质氧化后对酶切、PCR扩增等操作产生不良影响；在细胞膜裂解前用缓冲液洗涤叶片粉末,将部分多糖、多酚、RNA等杂质除去；对NaCl浓度进行调节,增加氯仿／异戊醇抽提次数,增强除去蛋白质、多糖等杂质的能力；增加裂解液CTAB含量,控制悬浊液离心温度,提高DNA产率。对CTAB法改良Ⅱ所提DNA通过琼脂糖凝胶电泳后,点样孔干净、主带清晰、无拖带、无RNA条带；紫外分光光度计检测OD260m/OD280nm为1.7～1.9,OD260m／OD230nm比值大于2.0,DNA产率在96.4～127.2μg.g-1之间,结果表明CTAB法改良Ⅱ可从石榴叶片中提取高质量、高产率的基因组DNA。(2)石榴ISSR-PCR反应体系优化：本研究首次采用正交设计L16(45)探讨了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Tag DNA聚合酶五因素对石榴ISSR-PCR的影响,并利用加权平均法及百分制对ISSR-PCR反应体系扩增结果进行评分,采用DPS数据处理系统分析实验数据,探讨各因素及各因素不同水平对反应结果影响的内在规律性。结果表明：各因素对PCR反应影响的大小依次为：Mg2+>dNTPs>Tag DNA聚合酶>引物>模板DNA,五个因素不同水平间的差异都达到了极显著水平；建立石榴ISSR-PCR最佳反应体系为(25μ1):Mg2+1.75 mmol.L-1、dNTPs 0.15 mmol.L-1、Tag DNA聚合酶1 U、引物0.8 mmol.L-1、模板DNA 20 ng。对石榴ISSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,确定各条引物最适退火温度。(3)石榴资源ISSR遗传分析：本研究从100条ISSR引物中筛选出重复性好、多态性高的6条引物：UBC 826、UBC 857、UBC 868、UBC 899、UBC 900,利用这6条引物对我国7个石榴主产区47个石榴品种进行了DNA多态性分析,共扩增出120条DNA条带,其中多态性带109条,多态性百分率为90.83%。利用PopGen32软件对试验数据进行分析,结果显示：7个石榴种群遗传多样性依次为：山东种群>陕西种群>云南种群>河南种群>安徽种群>四川种群>新疆种群；7个种群间的Nei’s基因分化系数(Gst)为0.191 1,表明分布在种群间的遗传变异占总遗传变异的19.11%,种群内遗传变异占81.89%,种群间表现出低水平的遗传分化；7个石榴种群间基因流的估测值(Nm)为2.116 9,种群间的遗传相似性(I)变化范围为0.921 8～0.975 9,表明种群间存在较强的基因流,遗传相似性很高。47个石榴品种中遗传相似系数(Sg)变异范围在0.600 0～0.9250之间,有效等位基因数(Ne)为1.2945±0.3094,Nei’s基因多样(H)为0.1897±0.1618、Shannon信息指数(I)为0.3091±0.2198,表明石榴在我国栽培过程中产生了较高的遗传变异,构成了较丰富的石榴品种资源基因库。用NTSYSpc-2.10 UPGMA法构建亲缘关系树状图,47个石榴品种被完全区分开,并分为5个类群。同时检测到15条特异性条带,可用于供试石榴品种中11个品种分子鉴定的参考性标记。(4)石榴AFLP体系优化：本研究选用MseⅠ为高频酶,EcoRⅠ为低频酶,确定石榴基因组DNA 20 u 1双酶切体系(MseⅠ为5U、EcoRⅠ为5 U、BSA为0.2μl、NEBuffer2为2 u1、基因组DNA为300 ng、ddH2O为14.05μl)最佳酶切时间为6 h；连接产物不稀释直接用于预扩增,预扩增程序为94℃2 min；94℃30 s,56℃30 s,72℃60 s, Go to 3 29 more times;72℃6 min,10℃hold;将预扩产物稀释20倍后进行选择性扩增,经检验优化的此AFLP体系能用于石榴遗传分析。(5)川滇石榴资源AFLP遗传分析：本研究从64对AFLP引物中筛选出重复性好、多态性高的5对AFLP引物为：E-AGG/M-CAA、E-AAG/M-CAA、E-ACA/M-CTC、E-AGG/M-CTG、E-AAG/M-CTG,应用这5对引物对四川、云南的42个石榴品种进行遗传多样性及亲缘关系分析,共扩增出362条DNA条带,其中多态性带235条,多态位点百分率(P)为65.66%。利用PopGen32软件对AFLP谱系进行分析,结果显示：每个位点有效等位基因数(Ne)为1.260 7、Nei’s基因多样性(H)为0.160 3、Shannon信息指数(I)为0.253 1；多态性百分率(P)为65.66%,表明四川、云南石榴品种之间的遗传变异较大,存在比较丰富的遗传多样性。用NTSYSpc-2.10软件对AFLP谱系进行分析,结果显示遗传相似系数(Sg)变异范围在0.712 7～0.925 4之间,UPGMA法构建亲缘关系树状图,5对引物可将42个石榴品种完全区分开,以遗传相似系数(Sg)0.82为阀值,42个石榴品种可分为4个类群,并在分子水平上显示供试品种间亲缘关系。同时检测到18条特异性条带,可用于供试石榴品种中的13个品种分子鉴定的参考性标记。确定蒙自的‘青皮石榴’与攀枝花的‘青皮石榴’为同名异物。