肝素一直以来仅作为抗凝和抗血栓药物用于临床,作为一种糖胺聚糖,其结构特点是高分子和高负电密度；从已经阐明的抗凝活性看,其活性是分子量和硫酸基所依赖的。近年来,肝素的抗炎、抗补体激活等非抗凝活性也得到关注,但尚未得到应用。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),又称早老性痴呆症,是一种神经系统退行性疾病,对老年人的健康产生极大威胁。AD的特征性病理学改变为大脑皮质神经细胞内神经原纤维缠结、细胞外大量老年斑形成和大脑皮质细胞减少。p-淀粉样蛋白(β-amyloid, AD)沉积被认为是老年斑的主要成分,也是阿尔茨海默病的发病机制之一。Ap的沉积被认为是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的代谢异常导致的。寡聚化的Ap和Ap沉积物又会引发对脑组织的一系列损伤,最终导致AD病变。其中,神经炎症,特别是对脑内补体系统的激活,是Ap的重要损伤机制之一。已有研究发现,肝素对APP代谢相关酶有着重要作用,对AD引起的神经炎症也存在着重要影响,但缺乏系统和深入的研究。本课题利用Ap损伤的神经元样细胞作为细胞模型,研究不同分子量和硫酸化程度肝素组分对APP代谢和AD引发的补体激活的作用,以阐明肝素结构与其抗AD活性的关系。本课题的研究内容及成果主要包括五个方面：1AD细胞模型的构建通过RA诱导分化人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y构建神经元样细胞模型。RA处理使SH-SY5Y的形态发生明显变化,形成神经元细胞特有的轴突的结构和细胞标记。利用MTT比色法测定Aβ1-42对神经元样细胞的损伤。确定用浓度为100μg/mL的Aβ1-42处理神经元样细胞24h可复制AD样细胞模型。2不同分子量和硫酸化程度肝素组分对神经元样细胞和AD样细胞存活率的研究利用MTT比色法测定了不同分子量和硫酸化程度的肝素组分对神经元样细胞和AD样细胞存活率的影响,包括肝素、依诺肝素、2-O-脱硫酸肝素、6-O-脱硫酸肝素、N-脱硫酸-乙酰化肝素、肝素二糖、肝素四糖、肝素十糖和肝素十六糖。不同肝素组分对神经元样细胞存活率没有显著性影响。而对于AD样细胞,分子量在3000-5000Da,且含有O-硫酸基和N-硫酸基的肝素组分,如依诺肝素、肝素十六糖等,能显著提高AD样细胞的存活率、抑制Ap对神经元样细胞的损伤的活性在所有肝素组分中。3不同分子量和硫酸化程度肝素组分对APP代谢作用的研究首次利用Ap损伤的神经元样细胞作为AD细胞模型,分析了Aβ1-42对神经元样细胞的APP代谢关键酶、APP和生成的相关片段的影响,以及肝素及其衍生物对Aβ1-42引起的上述变化的影响。Aβ1-42显著提高了BACE1的表达量,而肝素及其衍生物对其具有抑制作用,依诺肝素、肝素十糖和肝素十六糖对BACE-1生成的抑制作用最强。Aβ1-42提高了ADAM10前体及ADAM10表达量,但并不显著。结果提示肝素的硫酸基,特别是6-O-硫酸基和N-硫酸基,分子量在十糖到十六糖长度的糖链对肝素抑制Ap引起的APP代谢关键酶表达是必需的。Aβ1-42提高了AD样细胞的APP表达量,降低了C99的表达量,而C83的表达量基本不变,但这些影响并不显著。2-O-脱硫酸肝素和肝素二糖、四糖、十糖、十六糖使C83表达量明显增加,提示肝素对ADAM10的酶活力可能存在着重要影响。4不同分子量和硫酸化程度肝素组分对补体系统作用的研究免疫荧光检查发现,Aβ1-42促进神经元样细胞表达C5b-9,而且封闭CD59对表达量并无明显影响。肝素能抑制Aβ1-42引起的C5b-9表达。首次利用Aβ1-42损伤的神经元样细胞作为AD细胞模型,通过Wlestem b10tting分析了神经元样细胞细胞中不同系统相关蛋白的表达情况。Aβ1-42显著促进了C4a的表达,而肝素及其衍生物对C4a表达的抑制作用与肝素的硫酸基及分子量密切相关。6-O-硫酸基和N-硫酸基对于肝素抑制C4a表达的活性是必需的。十六糖或以上的肝素糖链才可能具有抑制C4a表达的活性。Aβ1-42也能显著提高C3的表达量,肝素及其衍生物对其的抑制作用不具有显著性影响。以上结果表明,肝素可通过调节APP代谢和Ap引起的补体系统激活抑制Aβ引起的对神经元样细胞的损伤,且这种作用都与肝素的硫酸化程度、硫酸基位置和分子量有关。从调节APP代谢和抑制补体激活的角度来看,具有抗AD活性的肝素应为十糖到十六糖的肝素寡糖,并具有所有的硫酸基,包括O-硫酸基和N-硫酸基。