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细叶百合(Lilium pumilum)是一种分布范围极广的百合属多年生草本植物,其适应能力强,观赏价值高,具有较强的抗逆性,是百合抗性育种的重要亲本。NAC家族是植物最大的转录因子家族之一,受多种生物和非生物胁迫诱导,不少研究已经证实NAC转录因子参与了植物发育、生长调节以及逆境应答等各个方面。本研究以实验室前期获得的细叶百合转录组数据作为依据,筛选出候选基因,以细叶百合鳞茎为材料克隆得到LpNAC6和LpNAC20基因,对其进行生物信息学和基因表达模式分析;利用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草株系;通过转基因烟草鉴定LpNAC6和LpNAC20的过表达是否响应盐胁迫,从而为细叶百合NAC基因的进一步应用奠定基础。具体研究结果如下:1.采用同源克隆技术成功克隆细叶百合LpNAC6和LpNAC20基因,其中LpNAC6基因长度909bp,编码302个氨基酸,LpNAC20基因长度1986bp,编码661个氨基酸。保守结构与分析显示,LpNAC6和LpNAC20基因均为NAC转录因子。荧光定量PCR的方法分析LpNAC6和LpNAC6和LpNAC20基因在各种非生物胁迫(高盐、干旱、低温和ABA)下的表达情况,发现LpNAC6和LpNAC20对高盐和干旱胁迫比较敏感。2.成功构建了中间载体pMD18-T-LpNAC6和pMD18-T-LpNAC20;双酶切后和植物表达载体pBI121-GFP连接构建植物表达载体pBI121-LpNAC6-GFP和pBI121-LpNAC20-GFP;利用基因枪法完成LpNAC6和LpNAC20基因在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位分析,结果显示LpNAC6和LpNAC20基因均在细胞核中表达;利用农杆菌介导法将LpNAC6和LpNAC20基因成功整合到烟草基因组中并表达;根据转LpNAC6和LpNAC20基因烟草T0代植株的表型强弱,各选出三个株系LpNAC6-2、LpNAC6-3、LpNAC6-5和LpNAC20-4、LpNAC20-6、LpNAC20-9,将它们的种子播种在选择压为50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选,获得转基因T1代植株。3.分别观察转LpNAC6和LpNAC20基因和野生型烟草种子在盐胁迫下的萌发率和幼苗生长情况。结果表明,盐处理下转基因LpNAC6和LpNAC20株系均表现出一定的耐受能力,种子萌发率和相对根长都大于野生型烟草。将成熟烟草植株(5～6片叶子)用300mmol/L NaC1处理15d后,野生型烟草出现黄化萎蔫及生长阻滞现象,而LpNAC6和LAC20基因过表达的转基因烟草仍然正常生长,且转基因植株的叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量和超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的活性均高于野生型植株。证明LpNAC6和LpNA0基因在烟草中的过表达能够增强其对盐肋迫的耐受性。