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研究背景与目的:梅毒作为一种慢性性传播疾病,其基本病理学特征是动脉内膜炎和血管周围炎,伴不同程度血管增生。血管反应是炎症反应的中心环节,血管内皮细胞和平滑肌细胞作为血管壁最主要的两种细胞在其中起重要作用。梅毒螺旋体不分泌外毒素,且外膜上脂多糖不具有内毒素活性。因此,梅毒螺旋体引起组织损伤和主要临床症状是由宿主炎症反应所致。而有关梅毒螺旋体致病机制目前还有待进一步阐明。梅毒螺旋体膜蛋白Tp47在梅毒螺旋体中含量高,免疫原性强,已经被广泛应用于实验室抗体检测,但在梅毒螺旋体感染中的致病作用,尤其是在梅毒螺旋体所致血管炎性反应和血管增生中的作用尚不清楚。为了探讨Tp47在梅毒螺旋体所致血管炎性反应和血管增生中的作用,本课题以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人皮肤血管平滑肌细胞（HDVSMC）为主要研究对象,展开以下研究:第一,分析Tp47刺激HUVEC后相关炎症因子表达水平,探讨Tp47活化HUVEC后对免疫细胞的趋化粘附作用;第二,探讨Tp47是否有促血管增生作用,以及基质金属蛋白酶（MMP）在该过程中所起作用和相关信号调控通路;第三,Tp47刺激HDVSMC,检测趋化粘附因子表达水平和细胞骨架蛋白F-actin改变情况,分析Tp47活化HDVSMC对免疫细胞的趋化粘附作用,以及参与这一过程的信号调控通路。通过以上研究探讨Tp47对血管壁细胞的影响,为梅毒螺旋体的致病机制研究提供相关理论和实验室基础。研究方法:1.Tp47刺激HUVEC 24小时,采用炎症因子芯片检测细胞培养上清液中相关炎性因子表达水平,对有变化的细胞因子采取RT-PCR进行验证。采用细胞趋化和粘附试验验证Tp47是否促进HUVEC对人急性单核细胞白血病细胞（THP-1）的趋化和粘附作用。2.Tp47刺激HUVEC后,采用基质金属蛋白酶芯片检测细胞培养上清液中MMP和基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）表达水平,并采用RT-PCR和ELISA进一步验证。采用CCK-8检测HUVEC增殖水平;Transwell和划痕试验检测HUVEC迁移水平;基质胶体外成管试验和斑马鱼体内血管形成试验检测Tp47促血管生成能力;RT-PCR检测HUVEC中相关MMP和TIMP mRNA表达水平;ELISA检测HUVEC中MMP和TIMP蛋白表达水平;Western blotting检测相关信号通路活化情况。3.Tp47刺激HDVSMC后,采用RT-PCR检测单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）mRNA表达水平;ELISA检测MCP-1蛋白表达水平;Western blotting和流式细胞术检测ICAM-1表达水平;细胞趋化和粘附试验检测HDVSMC对THP-1细胞的趋化和粘附;Western blotting检测相关信号通路活化情况,免疫荧光检测F-actin变化情况。在这部分研究内容中,我们平行开展梅毒螺旋体对HDVSMC的活化作用,检测趋化粘附因子表达水平,探讨梅毒螺旋体促进HDVSMC对免疫细胞的趋化粘附作用。研究结果:1.50 μg/mLTp47刺激HUVEC 24小时,炎症芯片结果显示:Tp47明显促进粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、ICAM-1、白介素（IL）-3、IL-6、IL6sR、IL-8、干扰素诱导蛋白10（IP-10）和MCP-1表达（P＜0.05）;嗜酸性粒细胞趋化因子（EOTAXIN）、EOTAXIN-2、粒细胞集落刺激因子（GCSF）、γ-干扰素（IFN-γ）、人 C-C 趋化因子 1（1-309）、IL-1α、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、MCP-2、巨细胞集落刺激因子（M-CSF）、IFNy诱导的单核因子（MIG）、巨噬细胞炎症蛋白lα（MIP-1α）、MIP-1β、MIP-1δ、重组人正常T细胞表达和分泌因子（RANTES）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、TNF-β、可溶性肿瘤坏死因子受体I（STNF RI）、STNF RII、血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）和 TIMP-2 表达无明显变化。为验证炎症芯片结果,我们采用RT-PCR对其中的GM-CSF、ICAM-1、IL-6、IL-8、IP-10和MCP-1 mRNA表达水平进行检测,结果显示Tp47以浓度依赖性方式显着增加上述炎性因子mRNA表达水平。进一步研究表明,Tp47刺激HUVEC后明显促进THP-1细胞迁移,抗MCP-1和抗IL-8中和抗体明显抑制THP-1细胞迁移数量。同时,Tp47以剂量依赖性方式增加了 HUVEC对THP-1细胞的粘附,使用抗ICAM-1中和抗体明显削弱了 Tp47刺激后HUVEC对THP-1细胞的粘附。2.首先,MMP蛋白芯片检测发现Tp47刺激HUVEC后促进MMP-1和MMP-10蛋白表达水平升高,而TIMP-1和TIMP-2蛋白表达水平无明显变化。进一步RT-PCR和ELISA结果显示,不同剂量Tp47可促使HUVEC中MMP-1和MMP-10的mRNA和蛋白表达水平升高,呈现浓度依赖性。TIMP-1、TIMP-2的mRNA和蛋白表达水平均无明显变化。其次,促血管生成相关试验显示,随着Tp47浓度增加,HUVEC的增殖、迁移和体外成管能力明显增强,呈现浓度依赖性。在斑马鱼模型中,可观察到Tp47明显促进斑马鱼肠下血管生成。siRNAMMP-1或siRNAMMP-10转染HUVEC后予以Tp47刺激,发现MMP-1或MMP-10的mRNA、蛋白和活性水平被明显抑制;同时,HUVEC增殖、迁移和体外成管能力也被显著削弱。最后,通过相关信号调控通路研究发现,Tp47刺激HUVEC后可激活AKT/mTOR/S6信号通路。AKT抑制剂（LY294002）和mTOR抑制剂（雷帕霉素）明显抑制AKT/mTOR/S6信号通路活化,抑制Tp47促进的MMP-1和MMP-10 mRNA、蛋白和活性水平,但TIMP-1和TIMP-2的mRNA和蛋白表达水平未受影响。同时,LY294002和雷帕霉素也抑制了 Tp47诱导的HUVEC增殖、迁移和体外成管。3.Tp47和梅毒螺旋体均以剂量和时间依赖性方式增加MCP-1和ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平。同时,Tp47和梅毒螺旋体促进了 HDVSMC对THP-1细胞的趋化和粘附,这一过程可分别被抗MCP-1和抗ICAM-1中和抗体抑制。进一步研究表明,Tp47刺激HDVSMC激活了 AKT、p38 MAPK和NF-κB信号通路;LY294002（AKT 抑制剂）、SB203580（p38 MAPK 抑制剂）和 BAY11-7082（NFκB抑制剂）明显抑制Tp47诱导的MCP-1和ICAM-1 mRNA和蛋白表达;同时也抑制了 Tp47 诱导的 F-actin 聚合。此外,LY294002、SB203580 和 BAY11-7082也明显抑制Tp47诱导的HDVSMC对THP-1细胞的迁移和粘附。结论:1.Tp47 促进 HUVEC 表达 GM-CSF、ICAM-1、IL-6、IL-8、IP-10 和 MCP-1;通过诱导MCP-1、IL-8和ICAM-1表达从而促进HUVEC对THP-1细胞趋化和粘附。2.Tp47 通过 AKT/mTOR/S6 信号通路上调 HUVEC 中 MMP-1 和 MMP-10表达水平,介导MMP/TIMP失衡,促进血管增生。3.Tp47 通过 AKT、p38 MAPK 和 NF-κB 信号通路调控 HDVSMC 中 MCP-1和ICAM-1表达,促进HDVSMC对THP-1细胞的趋化和粘附。总之,我们研究发现Tp47作用于血管壁细胞介导THP-1细胞迁移粘附和促进血管增生,这些发现为研究梅毒螺旋体致病机制提供了新的视角和依据,为深入探讨Tp47分子致病机制提供科学基础。