第一部分 背景与目的：非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是常见的恶性肿瘤，化学药物治疗(简称化疗)是肺癌综合治疗的一个重要部分。肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)是影响肺癌化疗疗效的主要障碍之一。紫杉醇(paclitaxel)作为一种新型的抗肿瘤药物，在NSCLC治疗上已显示出良好的发展前景。然而，其耐药性的产生以及越来越多交叉耐药现象的出现，已成为一道不容忽视的难题。因此，阐明其耐药机制，对于更好地选用治疗策略、筛选合适病人节约医疗资源、最大限度地避免或逆转耐药性的产生及化疗疗效的提高具有十分重要的意义。紫杉醇耐药性的产生是一个多途径过程，而体外建立多药耐药细胞系是研究肿瘤细胞产生多药耐药机制的重要手段。为了更深入地探讨非小细胞肺癌紫杉醇耐药产生机制，本研究拟构建耐紫杉醇的人肺腺癌细胞系，为后面耐药相关蛋白的研究打下基础。 方法：应用抗肿瘤药物紫杉醇(泰素，taxol)以体外浓度递增和短时作用法诱导人肺腺癌A549细胞株。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的耐药指数及对多种抗癌药物的敏感性；测定细胞群体倍增时间和细胞生长曲线；免疫组织化学检测P-糖蛋白(P-gp)、β-微管蛋白(β-tubulin)、GST-π、ERCC1、P53等耐药相关蛋白的表达；RT-PCR检测III型β微管蛋白在亲代及耐药细胞中mRNA的表达情况。 结果：经过15个月逐步增加剂量的药物诱导和克隆筛选，建立了能够在Img/L紫杉醇浓度下长期培养生长的细胞株，命名为人肺腺癌紫杉醇耐药株A549/Taxol。经MTT法检测，A549/Taxol细胞的紫杉醇半数抑制浓度(IC50)是亲代A549细胞的512.8倍，群体倍增时间是亲代细胞的1.28倍，对紫杉醇、丝裂霉素、长春新碱、诺维苯的耐药指数依次为512.8、66.48、4.88、2.66，表现为典型的MDR表型；而对顺铂、健择无交叉耐药。免疫组化检测见A549/Taxol细胞中高表达P-糖蛋白、β-微管蛋白。RT-PCR检测III型β-微管蛋白在耐药细胞中mRNA表达高于其亲代细胞系。 结论：建立了稳定耐紫杉醇的A549/Taxol，并呈多药耐药特性。其耐药机制可能与P-糖蛋白(P170)、β-微管蛋白等蛋白表达水平增高有关。 第二部分 背景与目的：既往大量的研究结果提示紫杉醇耐药现象的发生不是由单一基因或蛋白改变所引起，而可能是由多种蛋白网络式共同作用的结果。本实验在第一部分建立了肺腺癌耐紫杉醇细胞株，因此本研究拟在前期实验的基础上，应用高通量筛查差异表达蛋白的实验技术——蛋白质组学技术比较人肺腺癌细胞株(A549)和紫杉醇耐药细胞株(A549/Taxol)间差异蛋白的表达，拟发现与肺癌耐紫杉醇相关的特异蛋白标志物，希望能对非小细胞肺癌紫杉醇耐药机制进行探讨，为今后寻找非小细胞肺癌的治疗靶点或逆转耐药提供理论依据。 方法：提取非小细胞肺癌细胞株A549及紫杉醇耐药细胞株A549-Taxol的总蛋白，应用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离，获得二者高质量的蛋白表达谱，经Imagemaster5.0软件比较分析，筛选出二者间差异表达的蛋白点，通过质谱鉴定差异蛋白。应用Western blot技术对筛选出的CK18蛋白作进一步验证。 结果：获得了分辨率高、重复性好的肺癌耐紫杉醇细胞系及亲代细胞系双向电泳图谱。Imagemaster软件分析获得差异大于2倍以上的蛋白质点共有80个，其中33个在耐药细胞系中上调，47个下调。经质谱鉴定了20种蛋白，鉴定的蛋白涉及细胞骨架蛋白、代谢酶类、分子伴侣和信号转导相关蛋白等。差异明显的蛋白中，β-微管蛋白在紫杉醇耐药中研究比较成熟，而CK18蛋白与紫杉醇耐药关系的文献较少，由此考虑CK18可能为肺癌紫杉醇耐药的新靶点，应用Western blot技术对它作进一步验证，发现CK18表达水平在紫杉醇耐药细胞株中较亲本株中升高。 结论：非小细胞肺癌细胞株A549及紫杉醇耐药细胞株A549-Taxol相比，有许多蛋白在表达水平发生了显著改变。应用双向电泳技术整体展示了紫杉醇耐药细胞株及敏感细胞株的蛋白表达谱，并分析、鉴定、筛选出与紫杉醇耐药相关的差异蛋白，为进一步从多因素角度研究认识紫杉醇耐药机制提供了新的线索。通过Western blot对CK18鉴定获得了满意的CK18蛋白免疫印迹图谱，推测此蛋白有望成为肺癌紫杉醇耐药的新靶点。 第三部分 背景与目的：本研究第二部分通过对A549肺癌细胞株及A549/Taxol紫杉醇耐药细胞株的总蛋白提取，应用双向凝胶电泳(2-DE)技术获得了高质量的蛋白表达谱，经Imagemaster5.O软件比较分析、质谱鉴定出了差异蛋白，通过Western blot再次验证，确认CK18为差异明显的蛋白之一。由于前期研究发现CK18作为肿瘤治疗疗效预测因子已能在外周血清中测得，基于以上理论及实验依据，本部分拟前瞻性地获取晚期非小细胞肺癌紫杉醇化疗患者耐药前后外周血，作为自身对照以ELISA法检测其中的CK18水平，来评价CK18与紫杉醇耐药的关系，并为第二部分作进一步的临床验证。 方法：20例晚期非小细胞肺癌患者，紫杉醇175mg/m2，dl静脉滴入、卡铂以AUC=5计算用量dl静脉滴入，21天为一个周期，2～6个周期。按RECIST标准评定疗效。在患者化疗一个周期后评价疗效为病情稳定(SD)或以上，抽取外周血5ml抗凝，予以规范化疗，每周期后重新评价疗效，直到出现病情进展(PD)后再次抽取外周血5ml抗凝。酶联免疫吸附法检测耐药前后血清中CK18含量作为自身对照。 结果：20例患者耐药前血清CK18水平为0.3559±0.1990ng/ml；耐药后为0.5656±0.1893ng/ml。4例患者血清CK18水平略有下降(<20％)，但都为化疗2次，即抽血后第一次评价疗效时出现耐药；其余16例全部都出现升高(化疗2次以上出现耐药)，其中13例增高大于20％，最高达947.17％。配对t检验显示P=0.006，两组差异具有统计学意义。 结论：CK18的检测有助于预测紫杉醇化疗的疗效，并且对获得性耐药意义可能更大，可以为晚期NSCLC患者的个体化治疗提供可参考的依据。