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背景依赖利福平结核分枝杆菌简称依R菌(Rifampin-dependent Mycobacterium tuberculosis)是指某些结核分枝杆菌依赖利福平(Rifampin,RFP/R)生长的现象,是比耐药性变异更为严重的生物现象。依R菌感染的结核患者具有病情重、耐多药、化疗效果差和预后不良的临床特征,如果此类患者继续使用利福平,可导致病情加重,是化疗失败和难治性结核病产生的重要原因之一,因此依R菌结核病的早期诊断对临床治疗及预后有重大意义。目的本研究对依R菌中高表达的Rv0341蛋白进行分析,对其编码基因iniB进行限制性内切酶片段多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphisma, RFLP)。利用基因工程技术克隆表达Rv0341,纯化后鉴定重组蛋白的免疫原性和抗原性。建立以重组蛋白Rv0341为靶抗原检测血清Rv0341抗体的斑点免疫金渗滤试验(DIGFA),探讨其在依R菌结核病诊断中的临床价值,为进一步研究开发依R菌结核病诊断试剂盒提供理论依据和实验数据。方法1.通过SDS-PAGE、免疫印迹分析Rv0341在结核杆菌R依赖株、耐受株和敏感株中表达的差异,RFLP鉴定Rv0341蛋白编码基因iniB的多态性。2.自结核分枝杆菌H37Rv扩增iniB基因,通过基因重组技术构建于pET22b(+)表达载体,酶切、测序鉴定正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)IPTG诱导表达,Ni2+亲和层析纯化目的蛋白。鉴定其免疫原性和抗原性:以重组Rv0341蛋白免疫家兔,检测产生Rv0341抗体的效价;典型依R菌肺结核患者(阳性)血清、健康人(阴性)血清分别与重组蛋白进行Western-blot。3.以重组蛋白Rv0341为靶抗原建立检测血清Rv0341抗体诊断依R菌结核病的DIGFA法。4.以上述建立的方法对患者(依R菌、R敏感菌、R耐药菌感染的结核病患者)血清Rv0341抗体进行检测,评价其临床应用价值。结果1. SDS-PAGE、免疫印迹证实Rv0341在依R菌中高表达,表达量与R敏感菌和耐R菌有明显差异。RFLP证实其编码基因iniB在不同类型的结核杆菌(R敏感菌、耐R菌、依R菌)中不具有多态性,是保守基因。2.成功构建了表达重组蛋白Rv0341的工程菌,经超声破菌、SDS-PAGE、UVP扫描证实重组蛋白表达量约占总蛋白的25%,主要以包涵体形式表达。用Ni2+亲和层析柱对目的蛋白纯化,获得纯度为95%的重组蛋白。纯化重组蛋白免疫家兔产生了效价≥1:100 000的抗Rv0341抗体,与典型依R菌肺结核患者阳性血清发生反应,表明重组蛋白具有良好的免疫原性及抗原性。3.建立了以重组蛋白Rv0341为靶抗原的诊断依R菌结核病DIGFA法,该方法具有良好的重复性和稳定性。检测95份结核病患者血清,其诊断依R菌结核病的灵敏度为95.8%,特异性为81.7%,准确度为85.3%。结论1. RFLP结果证实iniB为保守基因,不同菌株Rv0341蛋白表达方面的差异不是基因突变所致,可能是在利福平诱导下引起转录水平变化所致。2.利用基因工程技术高效表达了重组蛋白Rv0341,并获得纯度较高的重组蛋白。3.建立了以重组Rv0341为靶抗原诊断依R菌结核病的DIGFA法,在初步应用中显示了较高的灵敏度和特异度,为研发诊断依R菌结核病DIGFA试剂盒奠定了理论和实验基础。