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犬流感是一种新发的,具有高度接触传播性的犬呼吸道传染病,患犬主要表现为咳嗽、肺炎以及其他呼吸道症状。其病原犬流感病毒为A型流感病毒,基因组为分节段的单链负股RNA,这一特点使病毒易通过基因突变和基因重配不断进化。目前韩国和中国地区对犬群的流感抗体血清学调查结果显示,H3N2犬流感病毒已在两个国家的犬群中广泛流行。犬作为一种伴侣动物,与人的接触十分密切,使人们担心该病毒具有潜在的从犬传播给人的可能性。因此,掌握犬流感病毒的进化方向及其致病生物学特性,有助于防控犬流感,特别是防止犬流感病毒传播给人,降低对人的风险性具有重要意义。本研究对江苏地区分离到的犬流感病毒进行基因特性和致病生物学特性分析,并探讨了其NA茎部两个氨基酸的插入对病毒复制的影响,为后续更深入地研究该病毒的致病机制奠定基础。1.江苏地区H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定及其分子特性2009-2010年,从江苏地区分离到6株H3N2亚型犬流感病毒。病毒全基因组测序分析显示,6株病毒之间同源性99%以上,且均与韩国报道的从猫分离到的禽源犬流感病毒最相似。与同源性最高的禽流感病毒片段的氨基酸序列比对结果表明,6株病毒在血凝素1(HA1)片段上发生了许多重要的突变,如抗原位点区域：D81N,A160T和G209；受体结合位点区域：W222L；裂解位点区域：K326R；潜在糖基化位点区域：T10A和D81N；在神经氨酸酶(NA)片段的抗原位点区域也发生了突变：S372L和R432G。值得一提的是,6株病毒在NA茎部的末端均出现了2个氨基酸的插入,且该突变在此前韩国与广东的犬流感病毒分离株中均未出现。系统发生树分析显示,6株病毒与此前韩国和中国地区分离到的H3N2亚型犬源及猫源流感病毒均在禽流感病毒谱系内,但与禽流感病毒不在一个分支,已形成独立分支,同时6株病毒与韩国猫源犬流感病毒亲缘关系最近。6株病毒中,06株较为特别：在M、NP和NA片段上,与其他5株病毒个别氨基酸不同；8个片段的系统发生树上,06株毒均与其他5株毒关系相对较远；06株毒的半数鸡胚感染量(EID50)最低。06株病毒的致病生物学特性值得进一步研究。2.H3N2亚型犬流感病毒江苏分离株的致病生物学特性分析选择01株与06株病毒接种BALB/c小鼠,套式PCR检测病毒脏器分布,发现两组接毒小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠以及粪中均能检测到病毒RNA,且均在攻毒后第6天病毒脏器阳性比率最高。通过荧光定量比较两组接毒小鼠在攻毒后第6天与第8天各脏器中的病毒RNA载量,显示接种06株毒的小鼠各脏器中的平均病毒载量较高。体重监测结果也显示接种06株病毒的小鼠体重下降更多。综合EID50、病毒载量及体重下降结果,确定06株病毒有更强的毒力。进一步免疫组织化学检测和病理组织学观察发现,接种06株毒的小鼠各脏器均能检测到抗原,且各脏器出现了不同程度的病理损伤。体外感染试验表明,06株犬流感病毒可以感染多种细胞,包括3种传代细胞系：犬肾细胞(MDCK)、人肺癌细胞(H292)、人肺腺癌细胞(A549),3种原代细胞：犬细支气管上皮细胞(CBE)、犬细支气管平滑肌细胞(BSM)、鸡胚成纤维细胞(CEF),并产生明显的细胞病变,间接免疫荧光检测进一步说明受感染的细胞内存在大量抗原。以上结果说明犬流感病毒对小鼠组织和体外培养细胞有广泛的嗜性。3.H3N2亚型犬流感病毒反向遗传操作系统的建立及其NA突变株的构建为建立H3N2亚型犬流感病毒反向遗传操作系统,将犬流感病毒A/canine/Jiangsu/06/2010(H3N2)的8个基因片段与双向转录表达载体pBD连接,构建了犬流感病毒8个基因片段的转录表达重组质粒。利用8质粒反向遗传操作系统,将重组的pBD质粒共转染293T细胞,72h后细胞冻融液转接MDCK细胞,并在MDCK细胞上传3代后,成功拯救该病毒,命名为r-06。同样的方法,以A/canine/Jiangsu/06/2010(H3N2)为框架,构建了重组NA基因茎部缺失2个氨基酸的突变毒,命名为r-06/NA2。两株拯救病毒的基因组经测序均无突变。r-06/NA2病毒的成功构建,为研究NA茎部2个氨基酸插入对病毒复制和毒力的影响提供了物质基础。4.H3N2亚型犬流感病毒NA茎部氨基酸插入对病毒体外复制的影响为探讨犬流感病毒江苏分离株NA基因茎部2个氨基酸的插入对病毒体外复制的影响,比较了两株拯救病毒r-06(长茎病毒,NA茎部有2个氨基酸插入)与r-06/NA2(短茎病毒,NA茎部无氨基酸插入)在MDCK细胞、鸡胚原代成纤维细胞和犬原代细支气管平滑肌细胞上的生长曲线,结果发现,相比r-06/NA2病毒,r-06病毒在3株细胞上能达到更高的峰值滴度,在各个时间点均产生更高的病毒滴度,而且在MDCK细胞上形成的空斑更大。流式细胞计数检测结果显示,在MDCK与BSM细胞上,r-06病毒感染的细胞更多,但在CEF细胞上,两株病毒感染的细胞数量一致。NS1蛋白表达量,在3株被感染的细胞内,r-06病毒均显著高于r-06/NA2病毒的表达量。红细胞解凝试验结果显示,2个氨基酸的插入有助于NA在犬红细胞上释放病毒粒子,而在鸡红细胞上则没有影响。以上结果表明,H3N2犬流感病毒NA茎部2个氨基酸的插入,增强了病毒的体外复制能力,推测该突变可能是病毒在犬体内产生适应性突变的结果。5.H3N2亚型犬流感病毒NA茎部氨基酸插入对病毒体内复制的影响将r-06和r-06/NA2两株病毒分别接种BALB/c小鼠,探讨NA基因茎部2个氨基酸的插入对病毒体内复制的影响。结果显示,两组接毒小鼠体重均出现下降,但接种r-06病毒的小鼠体重下降更多。接种r-06病毒的小鼠在攻毒后第6天与第8天病毒脏器分布最广,且病毒脏器阳性比率均达到100%。接种r-06/NA2病毒的小鼠虽然也在攻毒后第6天与第8天病毒脏器分布最广,但仅在第6天病毒脏器阳性比率达到100%。病理组织学观察显示,两株病毒均能引起受感染小鼠肺部出现间质性肺炎,但接种r-06病毒的小鼠肺部病变面积更大。荧光定量PCR检测结果显示,攻毒后第6天,两组小鼠脑中的病毒RNA载量差异显著(P<0.05)。同时,攻毒后第2天,接种r-06病毒的小鼠肺脏内IFN-γ水平显著高于接种r-06/NA2病毒的小鼠(P<0.05)。然而,鸡体试验表明,r-06或r-06/NA2病毒感染鸡,在阳性组织比率和病毒RNA载量,以及IFN-γ或TNF-α水平上均无明显差异。通过以上试验结果,推测2个氨基酸的插入增强了犬流感病毒在哺乳动物体内的复制能力,对禽类则影响不明显。