近年来随着生活环境的变化和医疗水平的提高,人们获得更长生存期的同时肿瘤的发生概率也越来越高。在临床上越来越容易遇到脊柱肿瘤和肿瘤脊柱转移的病人。脊柱肿瘤的手术一般范围较大,病人术后切口疼痛明显,是困扰临床的一个常见难题。术后切口疼痛会造成病人药物上瘾,止痛药物滥用等诸多社会问题。因而是否能够用更温和的中医药方法治疗术后切口的疼痛,替代现有的一些镇痛治疗方法有着重要的临床意义。瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels)是一组主要位于生物细胞膜上的离子通道,可被多种物理和化学刺激激活,参与多种生理和病理过程,其中许多通道与疼痛产生或抑制有关。TRPM8是近年发现的温度感受相关离子通道,可以被低温(<25℃)激活,因此又被称为“冷受体”。TRPM8为一同源四聚体,由四条相同的6次跨膜结构组成(S1-S6)。S1-S4作为电压感受器并且可以与某些化学物质结合。S5-S6与之间的环,成为通道孔洞的一部分,允许多种阳离子通过。温度或者化学激活TRPM8可以调控疼痛感受,抑制痛觉过敏,但是其机制不清楚。天然冰片是从樟科植物中获得的近乎纯粹单体的有机化合物结晶,其化学成分是右旋龙脑((+)-Borneol),属于小分子萜类。天然冰片在临床上的应用超过两千年,传统中医实践以及现代的临床和生物医学研究都表明冰片具有良好的镇痛作用,但其在体内作用的分子靶点从未被发现,分子细胞机制尚未被阐明。本实验用多种实验方法再次验证了冰片的镇痛作用。通过多种电生理实验和动物实验进一步研究了其镇痛机制。本课题首次从分子、细胞、组织和动物水平探讨了冰片激活TRPM8通道的分子机制,系统研究冰片对不同类型疼痛的作用以及TRPM8及其下游受体通路在冰片镇痛中的作用和机制。本课题的开展将为认识冰片镇痛的分子细胞机制以及TRPM8对疼痛的调控作用提供科学依据和理论基础。目的:研究传统中药冰片镇痛作用的分子生物学机制方法:通过临床实验和动物实验证明冰片具有良好的镇痛作用。利用膜片钳、钙荧光成像等电生理实验技术筛选冰片对一些疼痛相关离子通道是否有激活或抑制作用。体外培养DRG神经元,利用钙成像技术检测冰片对部分DRG神经元的作用,进而推测冰片作用的离子通道。通过基因突变的方法研究冰片作用相关位点。采用鞘内注射的方式,利用一些重要疼痛相关下游受体特异性抑制剂,进一步探索冰片与下游疼痛机制的关系。结果:本实验通过临床实验和动物实验的方法再次证明了冰片确实具有良好的镇痛作用,且镇痛作用强弱与其浓度大小相关。通过活细胞钙荧光成像实验筛选了一些疼痛相关离子通道,发现冰片能够特异性激活外源性表达在HEK293细胞上的TRPM8通道和内源性表达在小鼠背根节(DRG)神经元中的TRPM8通道;将人的TRPM8通道外源性表达在HEK293细胞中,运用膜片钳技术发现TRPM8通道介导的电流也能够被冰片激活。通过冰片和已知的TRPM8激动剂薄荷醇的比较发现,冰片的镇痛作用和薄荷醇相近,但其导致冷过敏的副作用更小。通过鞘内注射的方式发现,冰片的镇痛作用可能与阿片类受体,GABAa受体,甘氨酸受体无关,而与代谢型谷氨酸受体的激活有关。结论:1、冰片对脊柱肿瘤病人术后切口疼痛具有良好的临床镇痛作用。2、冰片的镇痛作用与激活TRPM8密切相关,而与抑制TRPA1关系不大。3、冰片与薄荷醇相比有更好的临床使用价值。4、冰片的镇痛作用的下游机制可能与激活代谢型谷氨酸受体有关。