论文部分内容阅读
目的：既往研究表明血清miRNAs可以作为脓毒症患者的生物学标记物。本研究旨在发现脓毒症相关的新的miRNAs标记物和蛋白标记物。本研究的研究目的分为以下几点：(1)利用niRNAs芯片技术在全基因范围内筛选脓毒症患者生存组和死亡组间差异表达的miRNAs,并在大样本血样中进行验证,以期筛选新的miRNAs生物学标记物。(2)利用Solexa测序技术预测新的miRNAs前体,并在临床样本中进行验证,以发现新的miRNAs。(3)研究前期研究中筛选的六种miRNAs中同脓毒症过程中的凝血功能紊乱相关的miRNAs。(4)研究已发现的miRNAs标记物预测靶基因编码蛋白是否为脓毒症患者的生物标记物。方法：本研究中涉及的实验技术包括miRNAs芯片分析,Solexa测序分析,荧光定量PCR技术及相关的生物信息学分析。具体的实验方法如下：(1)利用12张niRNAs芯片在年龄,性别,病情严重程度匹配的12例生存组和12例死亡组脓毒症患者间筛选差异表达的miRNAs。然后在118例脓毒症患者中将上述筛选到的差异表达的niRNAs行qRT-PCR验证。(2)对年龄,性别,病情严重程度匹配的9例脓毒症生存患者和9例脓毒症死亡患者的血清样本行Solexa测序分析,利用测序过程中预测到的新miRNAs行生物信息学分析,去除假的miRNAs前体,剩余的新miRNAs在脓毒症患者血清中利用荧光定量PCR进行验证。(3)测定脓毒症凝血功能正常和凝血功能异常患者血清中miR-223,miR-15a,miR-16, miR-193b*,miR-122和miR-483-5p的表达水平。并研究在两组差异表达miRNAs水平同常用凝血指标的相关性。最终研究miRNAs水平同相关凝血指标的动态变化。(4)对既往研究中鉴定的六种可以作为脓毒症生物学标记物的miRNAs进行靶基因鉴定和功能注释。然后利用ELISA方法检测脓毒症患者血清中这些靶基因编码蛋白的含量。以鉴定脓毒症患者新的血清蛋白标记物。结果：总结为一下几点：(1)经过miRNAs芯片筛选发现,miR-297和miR-574-5p在脓毒症生存者和死亡者间差异表达。在118例脓毒症患者血清中验证后,这两个niRNA在两组间差异表达,且P<0.001。研究证实miR-297同脓毒症患者的生存相关,而miR-574-5p同脓毒症的死亡相关。多因素二分类logistic回归分析显示,脓毒症阶段,SOFA评分和miR-574-5p可以联合预测脓毒症患者的病死率。这三个变量联合预测脓毒症病死率的曲线下面积为0.932(95%可信区间,0.887-0.977)。当截断点为0.288时,这三个变量的联合预测脓毒症患者病死率的敏感性为78.13%,特异性为91.84%。(2)经过Solexa测序分析共预测得到650种新的miRNAs前体。利用生物信息学分析后筛选到45种新的miRNAs,将这些新的miRNAs在10例生存组患者,10例死亡组患者和10例健康对照患者中行荧光定量PCR验证,最终验证得到41种新的miRNA。在这41种新的miRNA中,18种新miNRAs共同存在于生存组和死亡组,9种miRNAs在两组间差异表达。在24例死亡患者和32例生存组患者间利用荧光定量PCR验证这9种miRNA,结果6种新miRNAs差异表达。将6种miRNAs与严重程度评分(急性生理和慢性健康评估Ⅱ评分,APAHCE Ⅱ评分和序贯器官衰竭评分,SOFA评分)的联合分析表明,这6种miRNA的预测病死率的曲线下面积为0.969(95%可信区间,0.930-1.000)。当截断点在0.714时,6种miRNA预测脓毒症患者病死率的灵敏度为100%和特异度为82.6%。(3)在六种mniRNAs中,仅血清miR-122的水平在凝血异常(CA)组患者显著高于凝血正常组(CN)患者(P<0.001)。血清miR-122的水平同活化部分凝血活酶时间(APTT)(R=0.426,P=0.008)和纤维蛋白原(FIB,R=0.398,P=0.008)正相关,同抗凝血酶Ⅲ(R=-0.913,P<0.001)负相关。此外,miR-122同谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST),的相关性系数分别为0.663(P<0.001)和0.445(P=0.001)。在45例脓毒症患者血清中动态研究发现,在CA组中,miR-122水平在入ICU的第1天,第3天,第7天和第10天显著高于CN组,但是ISTH-DIC评分在两组间无显著性差异。(4)经过靶基因预测,ACVR2A(激活素A受体ⅡA型),FOXO1(叉头框01),IHH(印度刺猬),STK4(丝氨酸/苏氨酸激酶4)和DUSP3(双特异性磷酸酶3)作为最终筛选得到的预测靶基因,其编码的蛋白质将用于下一步脓毒症蛋白标志物的鉴定。ACVR2A (P<0.01)和FOXO1(P<0.01)水平在正常对照组,轻症脓毒症患者,重症脓毒症患者和脓毒性休克患者之间有显著差异。此外,ACVR2A (P=0.025), FOXO1(P<0.001), IHH (P=0.001)和STK4(P=0.001)水平在生存组与死亡组间差异表达。DUSP3水平在组间均无统计学差异。对4种差异表达蛋白质联合分析表明,这四种蛋白预测病死率的曲线下的面积是0.875[95%置信区间：0.785-0.965],这要高于SOFA评分(序贯器官衰竭评估)和APACHEⅡ(急性生理和慢性健康评估Ⅱ)评分。当预测概率的截断点为0.449时,四种蛋白预测脓毒症患者病死率的敏感性为68%,特异性为91%。蛋白水平动态研究表明,在所有的时间点,ACVR2A, FOXO1和IHH水平在生存组与死亡组间均差异表达。这四种蛋白联合预测脓毒症患者28天病死率的价值要高于SOFA评分和APACHE Ⅱ评分。结论：(1)miR-297和miR-574-5p在脓毒症患者生存组和死亡组间差异表达,而miR-574-5p,脓毒症阶段和APAHCHE Ⅱ评分联合预测脓毒症病死率具有较好的敏感性和特异性。(2)脓毒症患者的血清中存在大量未注释的小RNA序列,本研究新发现41种新的miRNAs,其中6种miRNAs联合预测脓毒症病死率的价值较高。(3)miR-122同脓毒症过程中凝血功能紊乱相关,其中与抗凝血酶Ⅲ高度负相关。(4)脓毒症相关miRNAs的靶基因编码蛋白可以作为脓毒症的生物学标记物。FOXO1可以作为脓毒症患者诊断和预后的生物学标记物。