阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种与年龄相关度较高的神经变性疾病,是老年期痴呆的主要原因,其引起的并发症是导致老年人死亡的最常见原因之一。临床表现以记忆障碍、认知障碍和精神障碍为主。由聚集在神经细胞外的以β淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)为主要成分的老年斑(Senile plaques,SP),和聚集在神经细胞内的由过度磷酸化的Tau蛋白形成的纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFT)共同构成AD的重要病理改变。在AD的相关研究中,基于AD发病病因的多个假说被相继提出:例如胆碱能假说、Aβ假说、Tau蛋白假说和炎性因子假说等。最近的研究通常采用最普遍接受的Aβ假说,但Aβ假说对这种束手无策的疾病复杂的病理生理过程还是无法完美的解释。做为老年斑主要构成成份的Aβ在体内的生成是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)通过β和"-分泌酶剪切得来,APP属于跨膜蛋白,其跨膜胞外部分可以被#-分泌酶或β-分泌酶(BACE1)切割,从而产生两类N端具有可溶性的APP大片段,即APPs#和APPsβ,其相对应的残留在细胞膜上的C端APP片段分别为CTF#和CTFβ。然后CTF#和CTFβ可以分别由"-分泌酶(PS1)水解剪切产生Aβ片段。AD患者体内形成的Aβ蛋白有多种存在形式:可溶性Aβ单体、寡聚体、不可溶的Aβ纤维等,无论何种形式的Aβ蛋白对神经细胞都具有毒性,会导致神经细胞变性,继而发生凋亡,其中关键的问题是哪种结构的aβ类型与ad的发病机理联系最密切。在既往很长一段时间人们认为在细胞外异常沉积的aβ蛋白是ad的病理标记物,它也被认为是启动神经细胞变性和程序性死亡的重要病因。但最近的研究数据显示,最早生成于细胞内的具有可溶性的aβ单体及寡聚物往往是真正启动ad发病过程的关键所在,与aβ纤维相比具有更强烈的神经毒性,其中可溶性的寡聚体被认为与ad的发病,病情进展密切相关,可溶性aβ寡聚体的水平被认为在疾病的发病过程中尤其重要。最近的研究也特别强调了aβ寡聚体在突触的损伤中占主导地位,在ad病理性标记物中是仅有的参与到大脑功能损伤的信号。而且它也构成淀粉样斑块、启动和促进了ad的病情发展。aβ片段生成后,aβ缩氨酸自发地聚集成为可溶性的aβ寡聚体,这些寡聚物形成的纤维,继而形成不溶的片状结构而最终堆积成为弥漫性斑块。aβ1-42寡聚体是由神经元和相关联的星型胶质细胞的共同作用下产生,它能够引起氧化应激损伤,加速tau蛋白的过度磷酸化,从而造成对突触和线粒体的毒性作用。aβ1-42寡聚体拥有对富含胆固醇的膜表面持久的损伤能力,这些主要存在于少突胶质细胞和神经髓鞘中。目前的研究提示aβ1-42寡聚体在ad的损伤中占主要地位。针对于aβ1-42寡聚体的靶向免疫治疗可能是解锁ad治疗困境的有力钥匙。抗体库技术是筛选不同生物抗体的有力工具,具体是将外源性多肽表达于噬菌体的表面。抗体库技术被用来筛选及鉴定人源化治疗性抗体。约30%用于临床治疗性抗体是应用抗体库技术开发所得。除去治疗的价值,抗体库技术正逐渐在研究领域被用于识别及鉴定的目的。表达在抗体库表面的抗体或外源性多肽通常是依赖于目的基因的核酸序列与噬菌体外壳蛋白融合而实现的。在抗体库技术中,噬菌体是包含外来目的多肽核苷酸序列的展示系统。从抗体库中筛选抗体有多次的生物淘选过程。每一次的淘选都使抗体得到进一步的富集,可通过增加淘选的次数使抗体得到有效富集。高亲和力的抗体保留,低亲和力的抗体被洗脱掉。多次生物淘选后,仅有高亲和力的特异性抗体被保留下来。这使快速简便筛选单克隆抗体成为可能。特异性抗体基于不同的特性而被筛选出来,这使抗体库技术成为抗体筛选和工程化的有效途径。噬菌体抗体库技术是生产特异性抗体的重要来源,为ad的单克隆抗体治疗提供了基础和保障。本系列研究以此为切入点,分三个部分探讨ad的单克隆抗体治疗的机制。第一部分,目的:构建人源性阿尔茨海默病噬菌体抗体库。方法:抽取20例ad病人的外周血,提取总rna,应用rt-pcr法得到人抗体vh和vl基因。将vh和vl连接,制备出scfv片段,然后将其酶切,再克隆到pcantab5e噬菌体载体上,电转化tg1感受态菌,辅助噬菌体m13k07超感染,构建出噬菌体单链抗体库。结果:从ad病人的外周血中成功提取总rna,逆转录pcr扩增vh,vl可变区基因,连接形成单链抗体,最终构建了库容为2.0$108的单链抗体库。bstnⅠ酶切鉴定构建的抗体库具有良好的多样性。结论:成功地构建了噬菌体展示的抗人阿尔茨海默病单链抗体库,为进一步筛选抗体,继而为ad治疗的进一步研究奠定了基础。第二部分,目的:筛选anti-aβ1-42特异性抗体。方法:以aβ1-42寡聚体为抗原,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”三步骤的生物淘选过程,并且在每轮结束时用洗脱得到的噬菌体来再次重复感染大肠杆菌,将其均匀涂布与sobag平板上,统计收获的百分率。在第四轮中,用筛选富集得到的阳性重组噬菌体来感染tgl,将其均匀涂布于sobag平板上。遵循随机化原则来挑取克隆,在辅助噬菌体m13k07的挽救下,分别生产出重组噬茵体抗体,用elisa方法对筛选到的阳性克隆进行诱导表达,sds-page和westernblot应用于特异性鉴定。结果:噬菌体抗体收获百分率呈上升趋势。大部分克隆产生的重组噬菌体都有较高的抗原结合活性。结论:4轮筛选后单克隆抗体得到有效富集。我们挑选活性最高的11a5进行下一步的研究。第三部分,目的:所筛选出的anti-aβ1-42抗体11a5进行初步效价研究。方法:将11a5、商品化抗体6e10分别与aβ1-42寡聚体混合后脑定位注射于sd大鼠,对照组仅注射aβ1-42,30天后行morris水迷宫实验。将11a5,6e10分别经腹膜内注射于app-ps1模型鼠,每两周一次。分别于治疗后1,2,3月分析外周血中aβ的水平,脑组织中aβ的水平。结果:30天后水迷宫实验显示抗体混合组的sd大鼠较抗体注射组的大鼠行为学改变不明显;app-ps1小鼠治疗后1,2,3月的外周血的aβ水平上升,脑组织中aβ下降,水迷宫实验显示学习记忆能力有明显改善。以治疗后1个月最明显。结论:11a5能够结合aβ1-42使其失活,并且降低app-ps1模型鼠脑组织内aβ的水平,外周血中aβ的升高提示单克隆抗体对脑内的aβ有驱除致其外流的作用。本系列研究成功构建了人源性阿尔茨海默病噬菌体抗体库,并通过4轮“吸附-洗脱-扩增”生物淘选使阳性克隆达到有效富集,挑选出活性最高的人源性单克隆抗体11a5。通过动物实验证明11a5不仅能够直接与aβ1-42寡聚体结合使其失活,而且能使脑内的Aβ外流到外周,同时降低脑内Aβ的水平,使Aβ的聚集受限。本系列研究为AD的单克隆抗体治疗提供了初步的理论基础。