基于光固化微流控芯片的一体化核酸提取与检测平台研究

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核酸检测在生物医学研究、疾病诊断等许多领域都具有重要价值。依托微流控芯片的数字PCR(Digital polymerase chain reaction,d PCR)是一种核酸绝对定量技术,具有超高的灵敏度和精度,尤其是液滴d PCR(Droplet d PCR,dd PCR),由于具有芯片加工简单、灵活性高等优点,在近年来获得了十分广泛的研究与应用。但当前dd PCR技术仍存在液滴易融合/破碎、液滴移动致实时荧光检测困难、液滴流失致珍贵样品/试剂浪费且难以精确定量试样体积等问题。此外,dd PCR前的核酸提取环节仍主要在芯片外进行,导致整个过程的集成化自动化程度低,且容易引起气溶胶污染。因此,亟需开发一种全程闭盖的一体化核酸提取与检测平台。针对这一需求,本论文主要基于光固化技术,通过逐步解决液滴的稳定性、无损失液滴捕获、及流道式芯片与微电极阵列的集成等问题,最终发展了一种集数字微流控核酸提取与dd PCR核酸检测于一体的微流控平台。主要工作包括:1)研制了一种光固化平面液滴阵列d PCR芯片。通过研发一种光固化油相,不但能生成粒径均匀可调的油包水液滴,而且可使液滴迅速固定为稳定的平面阵列,有效防止了液滴移动、融合和破碎;结合多层芯片设计,还成功克服了PDMS芯片普遍存在的试剂蒸发问题,使得dd PCR可以稳健地进行,同时具有良好的实时荧光检测潜力。2)开发了一种无损失液滴捕获的光固化微柱阵列d PCR芯片。通过优化设计一种蜂巢结构的微柱阵列,可使液滴捕获密度高达160-250个/mm~2,且没有任何损失,有效避免了试剂浪费,同时有利于精确定量试样体积;发展了光固化微流控芯片加工技术,可针对d PCR应用优化选材,避免了试剂蒸发及表面修饰,使芯片制备更加简便;进一步采用光固化油相,可使液滴阵列更加稳定,在实时荧光dd PCR方面具有良好潜力。3)发展了一种基于集成流道数字微流控芯片的一体化核酸提取与检测平台。首次开发兼具高介电常数与强疏水特性的光固化复合疏水介质层,并采用疏水性光固化材料制备通道结构层,成功发展了一种全封闭式集成流道数字微流控芯片,不仅加工过程简单,无需繁琐的疏水处理,而且可以方便地嵌入导电薄膜以形成双极板结构,实现了液滴生成、分裂、移动及融合全部基本功能。在此基础上,优化设计了芯片流道与电极结构,构建了全流程一体化的核酸提取与检测平台,在即时检测与临床诊断方面具有重要价值。
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