论文部分内容阅读
控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)是指通过运用促排卵药物使得一个月经周期能够获得足够数量的卵子，以便得到多个可供移植的胚胎。COH已经广泛应用于体外受精—胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF—ET)治疗不孕症中，并成为治疗中的关键步骤之一。20多年来随着辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)的不断开展与深入研究，用于ART的药物有了很大的发展、COH方案和监测手段不断得以完善。虽然临床妊娠率在不断提高，然而在启动周期中仍有超过半数的未能成功，目前探讨并改善影响成功率的因素已成为生殖医学领域的热门话题。卵子成熟障碍，卵巢反应低下，受精失败，胚胎发育障碍，着床障碍等都是IVF-ET失败的原因。本课题分为两大部分，主要研究方法和结果如下：第一部分COH中卵泡早、晚期孕酮水平对IVF结局的影响本部分的研究工作是对部分接受IVF助孕的不孕症患者的COH资料进行回顾性分析，探讨卵泡早期孕酮水平对IVF结局的影响。首先我们对2003年5月至2005年1月538名接受垂体降调节短方案超排患者的卵泡早期孕酮水平进行分析。根据她们在注射促性腺激素(Gonadotropin，Gn)第4天的血清孕酮水平分为三组：A组，血清孕酮≤1ng╱ml者367例；B组，血清孕酮1ng╱ml—3 ng╱ml者106例；C组，血清孕酮＞3 ng╱ml者65例，回顾性分析各组患者的一般资料、COH资料及IVF结局。结果：各组间注射hCG日的E2，LH，P水平，获卵数，移植胚胎数均无显著差异。受精率，优质胚胎率随着孕酮水平的升高逐渐降低，但无显著差异。我们发现B和C组超排卵第4天黄体生成素水平和孕酮水平比A组显著升高(P＜0.01)，雌激素也显著升高(P分别＜0.05和＜0.01)；C组的妊娠率和着床率比A组显著降低(P＜0.01)；而早期流产率显著增高(P＜0.05)；所以继续妊娠率较A组显著降低(P＞0.01)，C组的着床率比B组显著降低，但是早期流产率没有显著差异。B组的早期流产率较A组显著升高(P＜0.05)。结论：控制性超排卵中短方案垂体降调节中，注射Gn第4天，即卵泡早期孕酮水平＞3 ng／ml，胚胎着床率，妊娠率降低，孕酮水平＞1 n╱ml，早期流产率增加。接着，对2003年4月至2004年12月1408例不孕症患者，分别接受短方案垂体降调节692人和长方案垂体降调节716人卵泡晚期的孕酮水平进行分析，其中，按照注射HCG日血清孕酮浓度的不同分别分为3组：短方案组：血清孕酮≤1ng／ml者462例，血清孕酮1ng╱ml—2 ng╱ml者211例，血清孕酮＞2 ng╱ml者19例；长方案组：血清孕酮≤1ng╱ml者588例，血清孕酮1ng／ml—2 ng╱ml者108例，血清孕酮＞2 ng／ml者20例，回顾性分析体外受精的结局。结果：长短方案各组间获卵数，受精率，卵裂率，优胚率无明显差异，随着孕酮水平的升高，着床率和妊娠率有逐渐降低，自然流产率升高趋势，但是无统计学差异。结论：控制性超排卵中，hCG注射日孕酮水平对着床率，临床妊娠率，自然流产率无显著影响。对照组(17名)，均采用短方案降调节，其中生长激素组从周期第2-3天每天注射4IU生长激素，比较两组超排卵过程及结局。结果：两组间病人的年龄、不孕原因和不孕年限均无明显差异；两组病人超排过程中的各项参数，包括各时期内分泌结果，促性腺激素的使用时间，剂量，获卵数，受精率，卵裂率，优质胚胎率，移植胚胎数目均无显著性差异，最终GH组获得了42.1％的临床妊娠率，而对照组仅为13.3％，GH组有一例患者为宫外妊娠，其余均在继续妊娠中。两组病人中，超排周期第二天血清GH、抑制素、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGFBP3水平均无显著差异；超排周期第六天两组病人的抑制素水平无显著差异；注射HCG日中，GH组血清IGF-Ⅰ水平较对照组显著增加(P＜0.000)；IGF-Ⅱ水平在两组间无显著差异；GH组血清IGFBP3水平较对照组显著下降(P＜0.000)；两组病人卵泡液中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGFBP3水平均无显著差异。本研究对GH提高临床妊娠率进行了初步探讨。我们通过建立了卵巢黄素化颗粒细胞的体外培养体系，并向培养体系中添加不同浓度的GH和／或FSH，探讨生长激素在体外对颗粒细胞的分泌类固醇激素(E2和P)的调节作用，进而为进一步探讨其对卵泡发育的影响打下基础。结果：随着GH浓度的增加，培养液中E2水平不断增加，当GH浓度为500ng／ml时，与空白对照组比较，E2水平有显著差异性(P＜0.05)；当GH浓度为1000ng／ml时，与空白对照组比较，E2水平也有显著差异性(P＜0.05)；而各组培养液中P水平无显著差异；在相同浓度的FSH作用下随着GH浓度的增加，培养液中E2水平不断增加；在相同浓度GH作用下，随着FSH浓度的增加，培养液中E2水平不断增加，其中当FSH浓度在1000ng／ml时，分别与相同GH浓度的FSH空白组比较E2水平差异具有显著性(P＜0.05)；而各组间P水平无显著差异。然后收集经过GH(500ng╱ml)作用后的人卵巢颗粒细胞和空白对照组颗粒细胞为材料，应用以SMART(Switching Mechanism At 5’end of the RNA Transcript)技术为基础的抑制性消减杂交技术(SuppressionSubtractive Hvbridization，SSH)，以GH作用后的颗粒细胞为检测子(tester)，以对照组颗粒细胞为驱赶子(driver)，获得了GH作用后差异表达的cDNA产物。G3PDH基因扩增实验显示消减效率达10个循环左右(约1000倍)。进一步将cDNA产物克隆入pUCm-T载体，通过蓝白斑实验和PCR检测，筛选出在人卵巢颗粒细胞中，GH作用前后差异表达的克隆。反向斑点杂交结果显示大部分克隆在GH作用前后的颗粒细胞中的表达有差异。选取其中60个与GenBank比较，显示其中52个EST代表23个已知基因，4个EST代表4个假想基因，另外有4个属于未知EST。选取其中5个EST所代表的基因(CSNK2A1，EPS15，SP3，PSME2，RDX)进行半量RT-PCR分析，证实该5个基因在GH作用后的人卵巢颗粒细胞中高表达。研究这些基因的功能将为阐明GH对卵巢颗粒细胞以及卵泡发育的机制提供了基础。