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ISG60属于IFIT家族成员,是一类干扰素诱导基因,在进化上高度保守。在干扰素、病毒、脂多糖等条件的刺激下,ISG60基因高效表达,主要作用于翻译的起始、病毒的复制、I型干扰素的反馈调节、细胞的迁移和增殖等。ISG43于1999年首次被Liu等发现并报道其去泛素化功能,又称为UBP43,是泛素特异性蛋白酶(UBP)家族成员。2002年,Malakhov等首次发现UBP43的去ISG化ISGylation功能,部分缺失UBP43基因的细胞会发生干扰素过敏导致细胞凋亡,由此可见ISG43是维持ISG化动态平衡的关键。本研究克隆了 ISG60和ISG43基因,将这些基因连接到pMD18-T载体,测序正确后再用Xho I和BamH I双酶切法插入PET-32a(+)克隆位点,成功构建了 PET-ISG60和PET-ISG43重组原核表达质粒。将重组质粒转化Rosetta(DE3)衍生菌并用不同浓度的IPTG进行诱导,经SDS-PAGE 和 Western-Blot 分析显示,ISG43 在 0.5 mM IPTG 诱导下表达最好,ISG60在0.05mMIPTG诱导下表达最好,ISG43和ISG60两者的重组蛋白都能以包涵体和可溶性蛋白两种形式进行表达。通过可溶性蛋白形式纯化蛋白获得有活性的免疫原,以纯化的ISG43和ISG60重组活性蛋白作为抗原与弗式佐剂一起免疫小鼠。经过四次免疫后获得了反应性和特异性较高的多克隆抗体。用Western Blot检测,产生的抗体能与原核表达蛋白发生反应,又能与PK-15细胞中经PolyI:C诱导产生的相应蛋白显示良好反应性。抗体在稀释比例为1:2000、1:4000、1:8000情况下都能与原核表达蛋白发生特异性反应。同样,抗体在稀释比例为1:600和1:1200时也能与PK-15细胞中表达的相应蛋白发生反应。