肝素酶(HPA)是肿瘤转移过程中的关键酶,它通过特异性识别和降解乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)上的硫酸肝素(HS)侧链,从而破坏细胞外基质(ECM)和血管基底膜(BM)结构的完整性,并促使结合于硫酸肝素侧链上的生长因子、趋化因子、酶类分子等生物活性分子释放,在肿瘤生长转移、肿瘤新血管形成等过程中扮演重要角色。80年代中期首次发现HPA与肿瘤转移具有密切联系,但是由于HPA含量低,性质不稳定,纯化困难,无法对HPA性质及其在临床诊断中的应用进行深入研究。90年代末期HPA基因被成功克隆,使得关于HPA的研究进入了快速发展期。大量研究证实,几乎所有恶性肿瘤(包括白血病)发生时HPA表达水平和活性都会升高,特别是在肿瘤发生转移时HPA异常高表达,HPA与肿瘤的性质及预后密切相关。因此HPA的检测在肿瘤早期诊断、转移风险评估及疗效监测中有重要意义。基因重组技术使得HPA的表达得以实现,但由于HPA纯化难度大,所以到目前为止,除几个研究小组有粗纯化的活性HPA外,尚无商品化活性HPA。HPA的抗体是研究HPA性质及临床应用的前题。目前,商品化的HPA抗体多为以多肽为免疫原制备而成,只有MyBioSource公司有以全长HPA为免疫原的单克隆抗体,但价格昂贵(400$/0.05mg),同样由此获得的多抗也价格不菲(530$/0.24mg)。而到目前为止,尚无国产商品化HPA抗体。HPA在肿瘤组织中的高表达已被多家实验室证实,HPA含量检测主要是采用免疫组化、RT-PCR、Western-Blot等定性或半定量技术。与免疫组化和RT-PCR等检测方法相比,血清肝素酶ELISA检测法具有很多优点,例如取材方便,容易操作;定量准确,干扰因素少;方法简单,利于推广;采用双抗夹心ELISA方法,既可手工操作,也可通过自动化仪器完成。与常规肿瘤标志物同时检测更有利于肿瘤的筛查及临床辅助诊断。但目前,有关血液、体液中HPA水平定量检测的报道较少,国内尚无相关报道。HPA抗体费用高、使用量大可能是影响这类研究的主要原因之一,目前至少是影响本课题组开展这项研究的最重要原因。本研究旨在利用基因重组技术获得HPA、并以其作为免疫原制备HPA抗体;同时进行血液中HPA水平与肿瘤性质关系的研究,以进一步明确血液HPA水平作为临床肿瘤诊断辅助指标的可能性。利用本实验室保存的包含HPA全长序列质粒为模板,扩增除信号肽序列以外的肝素酶cDNA片段,将其插入表达载体pET-28a(+),转化到大肠杆菌BL21(plysS,DE3)中,并对起始诱导菌密度、诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度进行了优化,实现了重组人HPA的可溶性表达;采用HisTrap TMcrude亲和层析柱对目的蛋白进行了初步纯化,Western印迹实验证实表达产物具有HPA免疫学特性的蛋白表达产物。以原核表达的重组HPA为免疫原,对6～8周龄的雌性Balb/c小鼠进行皮下免疫,每隔3周皮下加强免疫,每只单次使用HPA量为30μg/只。4次免疫后,血清抗体效价达1×105。挑选效价高的小鼠,提取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞。一周后ELISA法筛选阳性克隆,再以有限稀释法进行亚克隆化,最终获得了4株阳性克隆细胞株,为下一步制备鼠抗人HPA单克隆抗体提供准备。在尚无自制抗体的情况下,我们选择了Abnova公司的鼠抗HPA单克隆抗体M05和Acris公司的兔抗HPA多克隆抗体PP1320配伍,其中以M05单抗作为包被抗体,PP1320多抗作为ELISA夹心法的另一抗体,进行血液HPA水平在健康人群和恶性肿瘤患者之间的比较。实验中对25例肺癌、42例消化道肿瘤患者及健康献血者血清HPA水平进行了检测,每个样本设置3个重复孔,健康献血者血清和患者血清在同一96孔板中检测。实验数据稳定,具可重复性;同时检测结果显示,肿瘤患者血清HPA水平明显高于正常人群,两组数据P均小于0.0001,与国外血清学研究结果相同。研究结果初步证明,血清HPA检测具备替代组织HPA检测的可能性,可用于反映机体内HPA表达情况。综上所述,本课题将去信号肽序列的肝素酶DNA片段插入到pET-28a(+)表达载体,在原核细胞中获得表达。以表达蛋白为免疫原,通过单克隆抗体制备技术,获得了阳性杂交瘤细胞株,为制备HPA抗体提供准备。本课题采用双抗夹心酶免实验建立了血清HPA的检测方法,对正常人和肿瘤患者血清HPA进行了检测和比较,初步证明了ELISA方法检测HPA水平的可行性,且检测结果具有临床意义。