猪瘟(Classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一类能在家猪和野猪中流行,具有高度传染性的传染病,严重威胁养猪业发展。CSFV是一种含有囊膜的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属成员,基因组长约12.3kb。病毒蛋白中,结构蛋白E2、Erns以及非结构蛋白NS3为主要免疫原性蛋白,其中E2诱导中和抗体,与病毒入侵和致病性紧密相关。我国对于猪瘟防控的主要策略为猪瘟兔化弱毒苗群体免疫,但无法通过血清学方法区分疫苗免疫和自然感染动物。研究表明,CSFV流行毒株也已经从之前的group 1转向group2,新基因亚型毒株不断出现。CSF呈现地方性流行,症状非典型化,甚至在免疫猪群中也有发病。因此,开发新型猪瘟分子标记弱毒疫苗仍然是当今研究热点。本课题主要研究目标：(1)利用特异性单克隆抗体探明猪瘟病毒1型和2型E2抗原区的差异；(2)构建基于疫苗C株、携带流行毒株E2基因的嵌合重组病毒,评估其安全性和免疫原性；(3)探索猪瘟病毒Erns核心抗原区氨基酸变异对病毒复制和病毒粒子形成的影响；(4)构建以C株为骨架、携带牛病毒性腹泻病毒Erns基因的嵌合重组病毒,评估其安全性和免疫原性。1.针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备与表位鉴定为探究猪瘟病毒疫苗株C-strain与强毒株和流行毒株囊膜糖蛋白E2抗原差异性,我们利用原核表达的SM株和HZ1-08株E2-AD抗原区蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术结合ELISA和IFA筛选,获得了两株稳定分泌抗E2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B10和4F4。免疫印迹、IFA和ELISA鉴定表明,2B10仅能与SM株反应,不能与C株和2型毒株反应；4F4能与2型流行毒株反应,与C株无反应性。已知第737位Cys突变的重组E2会破坏B/C区构象,从而影响相应单抗对该区域的识别。我们通过真核表达携带该位点突变的E2以鉴定不同单抗的识别区域,发现2B10识别线性表位,不受二级结构的影响；4F4识别构象表位,位于E2抗原区域B/C中。差异氨基酸反应性鉴定证实了2B10识别的线性表位仅存在于SM株E2,丙氨酸定点突变分析进一步证实其识别表位为707IXPXGXGG714。4F4识别构象表位位于流行毒株E2的N端高变区1(HAR1), Glu713为关键氨基酸。二株单抗均具备潜在鉴别诊断价值。2.携带流行毒株E2的嵌合重组猪瘟病毒疫苗C株的鉴定与免疫原性鉴于CSFV流行毒株的E2蛋白的抗原多样性,特别是它们与疫苗毒株之间的较大差异,可能影响疫苗的免疫保护效力。因此,在本实验室之前建立的CSFV-C株反向遗传学操作系统的基础上,构建了基于C株、携带流行毒株HZ1-08的E2主要抗原区域(870bp)和N端抗原高变区1(HAR1,90bp)的感染性克隆,拯救获得了2株嵌合重组病毒RecC-HZ-E2和RecC-HARl;HAR1缺失的感染性克隆无法拯救获得子代病毒。两株嵌合重组病毒与亲本病毒RecC在体外生长没有差异,能在兔体内复制,并诱导产生定型热反应和特异性抗体。嵌合重组病毒免疫猪后没有出现体温变化和临床症状：免疫后第14天RecC-HZ-E2免疫猪能够检测到低水平的病毒血症。免疫后第7-10天血清中能够检测到特异性E2和Erns抗体,嵌合重组病毒诱导产生的免疫血清与流行毒株E2的反应性和体外中和能力都明显高于亲本株RecC;免疫猪能够抵御强毒SM株以及流行毒株QZ14攻击,表明改造后的嵌合重组病毒可能比亲本株更有效提供对流行毒株的保护力。3.猪瘟病毒Erns核心抗原区氨基酸变异对病毒复制的影响猪瘟病毒Erns也能够诱导动物产生特异性抗体,我们证实核心抗原区AR2蛋白(aa84-160)占优势,其中aa117-125为关键氨基酸,单一突变这些氨基酸在体外能影响抗体的结合。我们试图在C株Erns上找到影响抗体结合而不影响病毒复制的关键氨基酸或抗原区,为开发“负筛选标记”弱毒疫苗奠定基础。结果表明,在C株全长感染性克隆上,核心抗原区AR2中aa117-125任一氨基酸单点或者连续缺失都无法拯救获得子代病毒粒子；而在SM株全长感染性克隆上,上述突变却都能够拯救获得病毒粒子,最长甚至可以将117-125全部缺失。我们推测Erns该区域在SM和C株之间作用有所差异,为探寻这一差异,我们以C株结构蛋白嵌合SM非结构蛋白的重组病毒(C和G)和SM结构蛋白嵌合C株非结构蛋白的重组病毒(D和E)的全长感染性克隆为骨架进行突变,能够获得117-118突变(缺失和Ala替换)的子代病毒,但其他位点氨基酸突变也无法拯救重组病毒。说明C株和SM株之间在Erns核心抗原区缺失对子代病毒产生的影响有差异,结构蛋白和非结构蛋白在其中均发挥作用。但由于以上重组病毒都无法在兔体内复制,也未能诱导特异性抗体,无法进行血清学分析。4.携带牛病毒性腹泻病毒Erns的嵌合重组猪瘟病毒C株的拯救及其生物学特性鉴定为开发能够区分野毒感染动物和疫苗免疫动物(Differentiation of infected and vaccinated animals, DIVA)的新型弱毒疫苗,我们构建了以C株为骨架,携带牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)基因型1b分离株Erns基因的嵌合重组病毒(RecC-B-Erns)作为候选疫苗株。RecC-B-Erns在体外培养细胞中生长特性与RecC一致；体内试验证明,它保持了亲本毒株RecC在兔体内复制并诱导产生定型热反应和特异性抗体的能力。猪免疫后第7-10天能够检测到与RecC相当水平的针对E2的特异性抗体,而针对Erns抗体生成时间较E2迟1-3天。重组病毒RecC-B-Erns的兔和猪全血清与BVDV 1b型Erns截短蛋白B-tErns-X反应性良好,而与C株截短蛋白C-Erns-Y没有反应性；相反RecC诱导产生血清或流行毒株感染血清与C-tErns反应性良好,而与B-tErns较差。受试猪未呈现任何临床症状,但能有效诱导体液免疫应答,并能抵御强毒株和流行毒株的攻毒,证明其良好的安全性和保护力,能够作为猪瘟标记弱毒疫苗的候选。此外,我们制备了分别针对C株Erns和BVDV 1b型Erns的单克隆抗体3E8和4D6,这两个单抗识别的均为线性表位,并且3E8只与猪瘟病毒Erns核心抗原区有反应,4D6只与BVDV 1b型Erns蛋白反应,二者识别抗原表位可用于下一步鉴别诊断试剂盒的开发。综上所述,本研究利用单克隆抗体探明了流行毒株与疫苗C株在E2部分区域抗原结构的差异,探明了E2高变区HAR1与中和抗体的形成密切相关；携带流行毒株E2或HAR1的嵌合重组病毒诱导针对2型的中和抗体能力高于亲本株RecC,免疫猪能够抵御强毒的攻击；携带BVDV Erns的嵌合重组C株猪瘟病毒对猪安全,具有良好的免疫原性。上述研究为新型分子标记弱毒疫苗的开发奠定了良好基础。