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研究背景随着糖尿病进程的发展,患者胰岛β细胞的功能障碍逐渐加重。胰岛β细胞功能障碍和数量减少是糖尿病发病机制中的关键因素,因此,抑制胰岛β细胞数量减少,促进其增殖对于糖尿病的治疗至关重要。研究发现,在糖尿病患者和糖尿病啮齿动物模型体内硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP,thioredoxin interacting protein)表达显著上调。TXNIP可抑制肿瘤细胞的增殖。因此,本课题推测TXNIP可影响糖尿病中胰岛β细胞的增殖,但其具体机制有待探究。大量研究表明,在啮齿动物中,胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor1,IGF-1)能刺激胰岛β细胞的生长且促进移植胰岛细胞的存活。IGF-1与IGF-1受体(IGF-1 receptor,IGF-1R)的结合能刺激胰岛β细胞增殖和维持β细胞数。有研究表明,TXNIP能显著诱导microRNA-200b的表达和胰岛β细胞凋亡,而microRNA-200b能抑制IGF-R的表达和下游AKT的磷酸,提示IGF-1信号通路有可能参与了TXNIP抑制胰岛β细胞增殖作用的发挥。因此,本课题推测TXNIP可通过抑制IGF-1R及其下游信号通路的表达进而影响TXNIP对胰岛β细胞的增殖抑制。为此,本课题在db/db鼠、TXNIP过表达MIN6细胞和TXNIP过表达及敲除鼠上进行探究,以期寻求糖尿病治疗的新方向。第一部分糖尿病鼠中TXNIP、IGF-1以及胰岛β细胞增殖的变化目的:本研究旨在观察糖尿病模型鼠db/db鼠中TXNIP、IGF-1及其受体和胰岛β细胞增殖的变化。方法:1.检测db/m和db/db鼠8周、10周、12周、16周的体重2.检测db/m和db/db鼠8周、10周、12周、16周的空腹血糖值3.Western blot检测db/m和db/db鼠胰腺组织中TXNIP、PCNA和IGF-1R的表达4.IHC观察db/m和db/db鼠PCNA的表达5.HE观察db/m和db/db鼠胰岛形态结构变化6.ICC观察db/m和db/db鼠胰岛β细胞数量7.ELISA检测db/m和db/db鼠血清中IGF-1和胰岛素的表达结果:1.糖尿病小鼠模型构建成功2.db/db鼠胰岛结构破坏且胰岛β细胞数量减少,胰腺组织PCNA表达降低3.db/db小鼠血清IGF-1水平降低,胰腺组织IGF-1受体水平升高,TXNIP表达升高结论:糖尿病鼠中胰岛结构破坏且胰岛β细胞数量减少,胰岛PCNA表达降低。小鼠血清IGF-1水平降低,胰腺组织IGF-1受体水平升高,胰腺组织TXNIP表达升高。提示在糖尿病中TXNIP、IGF-1与胰岛β细胞增殖之间可能具有一定的相关性。第二部分IGF-1信号通路参与了TXNIP抑制MIN6细胞的增殖效应目的:1.观察在小鼠胰岛β细胞MIN6细胞株中,TXNIP是否会抑制胰岛β细胞的增殖。2.观察TXNIP是否会影响IGF-1R的表达,TXNIP是否能通过影响IGF-1R及其下游的PI3K/AKT/m TOR信号通路来抑制胰岛β细胞的增殖。方法:1.用慢病毒构建TXNIP过表达(Ad-TXNIP-GFP)和沉默(TXNIP Sh-RNA)稳转MIN6胰岛β细胞株2.荧光显微镜观察细胞的转染率3.在各组中分别加入100 nmol/L IGF-1,培养48 h。4.Ed U法检测细胞增殖5.流式细胞数检测细胞Ki67的表达6.Cell Counting Kit-8法检测细胞增殖率7.Western blot检测其TXNIP表达、增殖相关指标PCNA、IGF-1R和p-PI3K、p-AKT、p-m TOR的蛋白表达8.免疫荧光观察细胞中IGF-1R和PCNA的表达结果:1.TXNIP过表达和干扰模型构建成功2.TXNIP过表达时MIN6细胞的增殖水平降低,且IGF-1对MIN6细胞的增殖效应降低。沉默TXNIP使IGF-1对MIN6细胞的增殖效应增高3.TXNIP过表达引起IGF-1R及其下游的PI3K/AKT/m TOR信号通路表达水平降低,沉默TXNIP使IGF-1受体表达增高结论:TXNIP可抑制胰岛β细胞增殖,该效应通过抑制IGF-1R及其下游信号通路的表达来实现。第三部分IGF-1信号通路参与了TXNIP抑制小鼠胰岛β细胞的增殖效应目的:1.观察在TXNIP过表达鼠和TXNIP敲除鼠中,TXNIP是否会影响胰岛β细胞的增殖效应。2.观察在TXNIP过表达鼠和TXNIP敲除鼠中,TXNIP是否会影响IGF-1R的表达,TXNIP是否能通过影响IGF-1R及其下游的PI3K/AKT/m TOR信号通路来降低IGF-1促胰岛β细胞的增殖效应。方法:1.普通C57小鼠、TXNIP过表达鼠和TXNIP敲除鼠,每组随机选取6只,腹腔注射IGF-1,50μg/kg/day,持续4周。2.HE观察TXNIP过表达鼠和TXNIP敲除鼠中胰岛形态结构变化3.ICC观察TXNIP过表达鼠和TXNIP敲除鼠胰腺组织中胰岛β细胞数量4.IHC观察TXNIP过表达鼠和TXNIP敲除鼠胰腺组织中PCNA的表达5.Western blot检测TXNIP过表达鼠和TXNIP敲除鼠胰腺组织中TXNIP、PCNA和IGF-1R的表达6.ELISA检测TXNIP过表达鼠血清中IGF-1和胰岛素的表达结果:1.TXNIP过表达鼠模型构建成功,TXNIP敲除鼠模型构建成功2.TXNIP过表达鼠中IGF-1对胰岛β细胞的增殖效应降低,TXNIP敲除鼠中IGF-1对胰岛β细胞的增殖效应增高3.TXNIP过表达引起IGF-1R及其下游的PI3K/AKT/m TOR信号通路表达水平降低,敲除TXNIP使IGF-1R表达增高结论:TXNIP可抑制胰岛β细胞增殖,该效应通过抑制IGF-1R及其下游信号通路的表达来实现。