论文部分内容阅读
研究背景:急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种血液系统恶性肿瘤,约60%-80%患者经过以柔红霉素（DNR）为代表的蒽环类药物联合阿糖胞苷（Ara-c）组成DA（3+7方案）方案诱导化疗后可获得完全缓解,然而在未接受异基因造血干细胞移植（HSCT）的患者中,仅仅20%的患者可获得长期无病生存,许多AML最终复发、耐药,成为难治性AML。难治复发的AML患者往往对常用的蒽环类化疗方案耐药。因此,寻找新的靶向药物联合传统蒽环类化疗药物作为新的治疗方案是目前研究的热点。有研究表明,PI3K/AKT/m TOR信号通路的激活影响肿瘤患者的生存,且50%-70%AML患者PI3K/AKT/m TOR信号通路持续性激活,故该通路的抑制剂可能成为治疗肿瘤的关键。本课题组前期研究发现m TOR抑制剂雷帕霉素可逆转阿霉素耐药株HL60/ADM对阿霉素的耐药,增加细胞凋亡率。雷帕霉素类似物依维莫司（RAD001,Afinitor）作为一种新型口服m TOR抑制剂,通过抑制m TORC1来阻断信号传导,对多种类型的实体瘤具有活性,相比雷帕霉素,依维莫司药物代谢动力学更加优越。依维莫司当前用于晚期肾细胞癌、室管膜下巨细胞星形细胞瘤和神经内分泌肿瘤。依维莫司在血液肿瘤中的作用鲜有报道。故本文研究依维莫司和柔红霉素在白血病中的作用和分子机制。目的:研究m TOR抑制剂依维莫司联合柔红霉素抗髓系白血病细胞作用及分子机制。方法:1.CCK8法检测依维莫司单独或联合化疗药物柔红霉素处理HL60、HL60/ADM细胞株后细胞的增殖情况。用不同浓度的柔红霉素（12.5、25、50、100、200 n M）、依维莫司（2.5、5.0、10、20、40、60μM）处理HL60细胞24h、48h、72h;不同浓度的柔红霉素（78.125、156.25、312.5、625、1250、2500 n M）、依维莫司（6.25、12.5、25、50、100μM）处理HL60/ADM细胞24h、48h、72h。计算半数抑制浓度（IC50）及联合用药指数（CI）,找出二者适宜的联合用药药物浓度进行后续Western Blot实验,观察依维莫司联合柔红霉素是否能增加HL60/ADM细胞对药物的敏感性。2.采用Annexin-V流式细胞术检测细胞凋亡,用不同浓度的依维莫司10,20,40μM处理HL60细胞;用不同浓度的依维莫司5,10,20,40,80μM处理HL60/ADM细胞株,检测药物处理前后对细胞凋亡的影响。3.采用Western-blot检测依维莫司单独及联合柔红霉素对HL60、HL60/ADM细胞中PI3K/AKT/m TOR信号通路分子表达的影响,检测m TOR相关核糖体蛋白S6激酶,凋亡及抗凋亡相关蛋白BAX,BCL-2,PARP,Caspase家族蛋白的表达变化。结果:1.依维莫司和柔红霉素对HL60、HL60/ADM细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性。依维莫司下调柔红霉素作用HL60和HL60/ADM细胞的IC50,二者有协同作用。（1）CCK-8检测柔红霉素作用HL60和HL60/ADM细胞48h的IC50,分别是66.96±19.05 n M和711.67±74.74 n M,与HL60相比,HL60/ADM的耐药指数超过10,确定HL60/ADM为柔红霉素耐药株。（2）CCK-8检测依维莫司作用HL60和HL60/ADM细胞48h的IC50分别是16.23±1.49μM和33.00±4.09μM,HL60/ADM对依维莫司耐药指数为2,说明HL60/ADM对依维莫司也存在一定的耐药性。（3）CCK-8检测依维莫司（10μM）联合柔红霉素作用HL60细胞48h后,柔红霉素的IC50降至7.99±2.40 n M,显著下调（P<0.05）。（4）依维莫司（20μM）联合柔红霉素作用HL60/ADM细胞48h后,柔红霉素的IC50降至137±3.61 n M,显著下调（P<0.0001）。（5）分别计算HL60和HL60/ADM两组两药联合用药指数均小于1,说明依维莫司和柔红霉素杀伤细胞具有协同作用。2.依维莫司可增加髓系白血病细胞的凋亡,呈剂量依赖性。Annexin V流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,随着依维莫司药物加入48h后,HL60和HL60/ADM细胞的凋亡率均随着药物剂量的加大而增加。3.依维莫司联合柔红霉素可以通过调控PI3K/AKT/m TOR信号通路进而促进HL60和HL60/ADM细胞凋亡。Western blot结果显示:单独应用柔红霉素作用HL60和HL60/ADM细胞48h后,检测PI3K/AKT/m TOR信号通路分子,两细胞株均可见BAX蛋白表达上调,其余蛋白未见明显表达差异;单独使用依维莫司作用HL60和HL60/ADM细胞48h后,检测PI3K/AKT/m TOR信号通路分子,均可见m TOR,P-m TOR,RPS6下调,BAX上调;在HL60细胞中,依维莫司联合柔红霉素后,可见PI3K,AKT,m TOR,P-m TOR,RPS6,Bcl-2均下调,且下调作用大于依维莫司或柔红霉素单独作用的结果,BAX,Cleaved-PARP均上调,Casepase3变化不大;在HL60/ADM细胞中,依维莫司联合柔红霉素后,可见PI3K,AKT,P-AKT,m TOR,P-m TOR,RPS6,Bcl-2均下调,下调作用大于依维莫司或柔红霉素单独作用的结果,BAX,CleavedPARP均上调,Casepase3变化不大。结论:1.依维莫司联合柔红霉素协同杀伤HL60和HL60/ADM细胞,并激活PI3K/AKT/m TOR信号通路,增加HL60和HL60/ADM细胞的凋亡。2.依维莫司联合蒽环类药物可能是临床逆转复发难治性白血病耐药的一条途径。