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荧光探针是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长光的激发下使荧光剂产生荧光,通过检测所产生的的荧光实现对被检测物质进行定性或者定量分析的分子工具。与传统的分析方法相比,荧光探针具有灵敏度高、选择性好、使用方便、生物毒性小等优点。有机小分子荧光探针作为荧光探针家族中的一员,在离子、小分子、生物大分子的检测中扮演着重要角色,成为现代生命科学和疾病诊断不可或缺的分子工具。近年来,有机小分子荧光染料备受科研工作者的关注,众多有机小分子探针平台应运而生,如香豆素类有机小分子荧光探针平台、荧光素类有机小分子荧光探针平台、罗丹明类有机小分子荧光探针平台等等。然而,众多探针平台多采用单光子激发和单通道发射,其进行检测分析过程易引起光漂白、光损伤,具有组织穿透深度低、检测环境干扰大等缺点。随着科学技术的进步与发展,对实验结果准确度的要求越来越高。高的信噪比是有机小分子荧光探针面临的一大挑战,双光子成像技术及比率技术的发展有效的弥补了传统有机小分子荧光探针存在的不足。与单光子相比,双光子采用长波激发,有效的避免了光漂白、光损伤、组织穿透深度低等缺点;比率探针具有双通道发射特性,给出比率信号,因此检测结果受检测环境干扰较小,信号输出相对真实可靠。将双光子成像技术与比率技术引入有机小分子探针的设计中,在很大程度上提高了传统有机小分子荧光探针的性能。本文据此具体开展了以下工作:(1)构建基于苯并吡喃-荧光素杂交的能量转移型双光子比率荧光分子平台。选用具有双光子吸收特性的苯并吡喃与易于功能化识别单元的荧光素染料,通过分子杂交构建新的探针平台。该平台采用双子激发,有效的弥补了单光子激发的不足,苯并吡喃、荧光素分别作为能量给体和受体,通过二者之间的荧光共振能量转移(FRET)效应获得该探针的比率输出信号,有效的降低检测环境对输出结果的干扰。(2)苯并吡喃-荧光素杂交的FRET型小分子双光子比率荧光探针选择性检测由一氧化氮(NO)和硫化氢(H2S)相互作用产生的次硝酸(HNO)。在工作一中构建的探针平台末端通过酯键与二苯基膦苯甲酸连接,功能化修饰HNO的识别位点,通过收集外源性HNO或者NO与H2S在复杂生物体内相互作用产生的内源性HNO存在前后的探针荧光信号的变化,达到对外源性及由NO与H2S相互作用产生的内源性HNO的检测目的。(3)苯并吡喃-荧光素杂交的FRET型小分子双光子比率荧光探针选择性检测多硫化氢(H2Sn)。在探针末端通过酯键与甲基丙烯酰氯相连,功能化修饰H2Sn的识别位点,分析H2Sn存在前后探针的比率信号,对H2Sn进行合理检测。