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目的:射频消融(radiofrequency ablation,RFA)技术被广泛用于不可切除结直肠癌肝转移(colorectal cancer liver metastasis,CRLM)的治疗,但消融不彻底导致的局部肿瘤进展(local tumor progression,LTP)严重影响预后。据报道,miR-34a-5p参与了结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的转移过程,并在CRLM早期诊断和复发监测中具有重要价值。本研究探讨miR-34a-5p及其潜在靶基因“转移相关蛋白2(metastasis-associated protein 2,MTA2)”对CRC细胞增殖、迁移、侵袭功能的影响。探索适合用于RFA研究的CRLM动物模型建立和消融操作的方法,并证实miR-34a-5p在不完全消融组织标本中的表达与完全消融和假消融组织标本中的表达存在差异。此外,在CRLM患者中进一步评估RFA前、后血浆miR-34a-5p表达变化对RFA后LTP的早期预测价值。研究方法:1、应用RT-qPCR方法检测40对人CRC及对应癌旁标本中miR-34a-5p的表达情况,分析miR-34a-5p表达与CRC患者临床病理特征的关系。2、RT-qPCR方法检测miR-34a-5p在CRC细胞系和正常结肠上皮细胞中的表达;通过细胞增殖实验、伤口愈合实验和transwell侵袭实验在两种CRC细胞系中证实miR-34a-5p对CRC细胞功能的影响。3、TargetScan预测MTA2为miR-34a-5p的潜在靶基因,通过双荧光素酶实验证实miR-34a-5p与MTA2的靶向调节关系;再通过RT-qPCR和蛋白质免疫印迹实验(western blot,WB)检测miR-34a-5p对MTA2 mRNA和蛋白表达的影响。4、采用MTA2 shRNA干扰MTA2的表达,证实抑制MTA2表达对CRC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;再通过拯救实验证实抑制MTA2表达是否可恢复anti-miR-34a-5p对CRC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。5、Balb/c-nu裸鼠肝转移瘤模型制备及RFA干预。3只Balb/c-nu裸鼠皮下成瘤,作为肝转移瘤的移植瘤源。将皮下肿瘤剥离并剪切成lmm~3的小组织块儿,开腹方法将小组织块儿移植至15只裸鼠的肝左叶,SPF条件下饲养4周,形成肝转移瘤模型。将15只Balb/c-nu裸鼠随机分成3组:组1为假消融组,仅将射频电极针刺入肝转移瘤组织,不通电;组2为不完全消融组,将电极针刺入肝转移瘤边缘位置,确保远离电极针一侧的肿瘤不被完全毁损;组3为完全消融组,将电极针刺入肝转移瘤的中心位置,确保肿瘤组织被完全毁损。RFA术后24h处死全部裸鼠,收集标本:组1完全保留肿瘤标本;组2剥离凝固坏死组织,保留凝固坏死旁的肿瘤组织;组3剥离凝固坏死组织,保留凝固坏死周围5mm的肝组织。6、RT-qPCR检测各组标本中miR-34a-5p的表达情况,比较不同组标本中miR-34a-5p表达的差异。7、选取我院2016年01月至2017年12月期间42例行RFA治疗的CRLM患者为研究对象,随访至2018年12月。收集RFA术前、术后24h和术后7d的血浆标本,RT-qPCR检测miR-34a-5p的表达。分析RFA前miR-34a-5p表达与CRLM患者临床病理特征的关系。8、RFA术后1、3、6个月及之后的每3个月复查肝脏增强CT检查,评估肿瘤进展情况。根据RFA治疗后的LTP情况,将CRLM患者分为LTP组和无LTP组,比较不同时间点两组血浆miR-34a-5p的表达。Cox回归模型分析影响无局部肿瘤进展生存(local tumor progression-free survival,LTPFS)的独立预测因素。结果:1、miR-34a-5p在40例人CRC组织中的表达低于癌旁组织(P<0.05)。随着肿瘤TNM分期的进展,miR-34a-5p表达呈下降趋势,miR-34a-5p在TNM III-IV期CRC组织中的表达低于TNM I-II期(P<0.05)。将miR-34a-5p在40例CRC组织标本中的平均表达值0.77(范围:0.33～1.96)作为截断值,miR-34a-5p表达水平与肿瘤分化、淋巴结转移和TNM分期相关(P<0.05);与年龄、性别和肿瘤大小无关(P>0.05)。2、miR-34a-5p在CRC细胞系(LoVo、HCT116、HT29和SW480)中的表达均低于正常结肠上皮细胞(P<0.05)。选择miR-34a-5p表达最低(LoVo)和最高(SW480)的两种CRC细胞系进行后续实验。CCK-8实验、伤口愈合实验和transwell侵袭实验证实miR-34a-5p可抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3、双荧光素酶报告系统显示:miR-34a-5p表达上调可降低野生型MTA2的荧光素酶活性(P<0.05),但对突变体和对照组的荧光素酶活性无显著影响(P>0.05)。RT-qPCR和WB实验结果显示:miR-34a-5p可在转录和翻译水平影响MTA2 mRNA和蛋白的表达。此外,MTA2 mRNA在40例CRC组织标本中的表达高于癌旁组织(P<0.05);miR-34a-5p与MTA2 mRNA表达呈负相关(P<0.05)。4、MTA2 shRNA可在转录和翻译水平抑制MTA2 mRNA和蛋白表达;MTA2表达下调后,SW480细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降。拯救实验结果显示:共转染anti-miR-34a-5p和MTA2 shRNA慢病毒载体后,SW480细胞的增殖、迁移和侵袭能力较anti-miR-34a-5p和shRNA-NC组有所下降。综合上述实验结果,mi R-34a-5p可通过靶向调节MTA2表达影响CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。5、15只Balb/c-nu裸鼠肝转移瘤模型均构建成功,瘤体的直径为9.3±0.7mm。依据不同的分组原则,对3组Balb/c-nu裸鼠的肝转移瘤进行RFA干预,整个实验过程顺利,无实验动物死亡。6、miR-34a-5p在各组标本中的表达情况如下:假消融对照组1.24±0.15,不完全消融组0.40±0.08,完全消融组1.91±0.24。与假消融对照组和完全消融组相比,不完全消融组miR-34a-5p表达显著下降(P<0.05)。7、miR-34a-5p在42例CRLM患者血浆中的表达为1.69±1.05;miR-34a-5p表达与原发肿瘤分化和消融边缘大小相关(P<0.05),与患者年龄、性别、肝转移灶数目和大小无关(P>0.05)。8、对42例CRLM患者的68个肝转移病灶随访,中位随访时间24个月,中位生存时间34个月,1年和2年的OS率分别是90.5%和70.9%。共计24例患者(57.14%,24/42)的25个病灶(36.76%,25/68)出现LTP。其中,16例患者(38.10%,16/42)的17个病灶(25.00%,17/68)在RFA后的第一年出现LTP,占LTP总数的68%(17/25)。42例CRLM患者RFA后24h血浆miR-34a-5p表达与RFA前比无显著差异(P>0.05);而RFA后7d血浆miR-34a-5p表达较RFA前显著升高(P<0.05)。其中,LTP组(n=24)RFA后7d血浆miR-34a-5p表达较RFA前下降(P<0.05);而无LTP组(n=18)RFA后7d血浆miR-34a-5p表达较RFA前上升(P<0.05)。我们将RFA后7d与RFA前血浆miR-34a-5p的比值定义为“miR-34a-5p变化率”,miR-34a-5p变化率≤0.5视为RFA后7d血浆miR-34a-5p下降显著。Cox单变量分析结果显示:肿瘤大小、miR-34a-5p变化率和消融边缘在预测LTPFS方面是显著的(P<0.05),进入多因素分析。Cox多变量分析显示:miR-34a-5p变化率≤0.5(P=0.045,HR=2.557,95%CI:1.023-6.394)和消融边缘≤5mm(P=0.012,HR=3.470,95%CI:1.313-9.169)为较短LTPFS的两个独立预测因素。结论:1、miR-34a-5p可通过靶向调节MTA2表达抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭,在CRC的发生和发展中发挥重要作用。2、miR-34a-5p在不完全消融的Balb/c-nu裸鼠CRLM模型中表达显著下降,可能具备早期预测CRLM患者RFA后LTP的能力。3、RFA前、后血浆miR-34a-5p的动态变化和消融边缘是CRLM患者LTPFS的独立预测因素,有助于早期预测RFA后的LTP,可为临床医生设计个性化随访方案和治疗策略提供依据。