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番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)引起的番鸭以软脚,肝、脾出现大量灰白色坏死点为主要特征的病毒性传染病,对我国番鸭饲养业造成巨大经济损失。番鸭呼肠孤病毒病活疫苗(CA株)可有效预防本病,但MDRV致病和致弱的分子机理尚不清楚。本研究以MDRV强毒株(MW9710株)和疫苗株(CA株)为材料,分别构建了 MDRV强毒株和弱毒株S组基因的感染性克隆载体,结果如下:1、MDRV强弱毒株S组基因cDNA分子克隆构建:提取病毒核酸,设计针对S组基因的特异性引物进行RT-PCR,克隆测序获得了病毒S组基因序列。结果显示:MDRV两株对应基因长度相同,其中S1基因1324 bp,S2基因1201 bp,S3基因1191 bp,S4基因1124 bp;两株核苷酸序列与MDRV参考毒株同源性均大于98%,证实扩增获得了 MDRV强毒株和弱毒株的S组基因。2、MDRV S组基因编码的氨基酸差异及蛋白理化性质分析:利用MegAlign和Protean软件对强毒MW9710株和弱毒CA株S组基因编码氨基酸及蛋白进行比较。结果显示:σA蛋白为2个同极性疏水氨基酸替换:301aa(A→V),409aa(A→V);σB蛋白为12个氨基酸替换,多为亲水性氨基酸替换:5aa(V→A),21aa(W→R),40aa(S→P),65aa(M→T),85aa(P->S),96aa(I→T),113aa(Y→H),120aa(S→F),218aa(S→P),244aa(D→G),265aa(G→S),347aa(A→T);σNS 蛋白为1个同极性亲水性氨基酸替换:273aa(S→T);p10蛋白为3个疏水性氨基酸替换,46aa(A→V),70aa(H→Y),73aa(H→Y);σC蛋白为8个氨基酸替换,多为疏水性氨基酸替换:162aa(H→Y),167aa(F→I),168aa(T→I),172aa(S→F),197aa(P→S),198aa(T→M),206aa(P→F),264aa(L→F)。在分子量和等电点两方面比较中均有明显差异的为σB蛋白和σC蛋白,其中σB蛋白分子量下降,等电点升高,而σC蛋白分子量升高,等电点下降。3、MDRV S组基因感染性克隆载体构建:根据MRV感染性克隆构建的思路,获取含,SapⅠ酶切位点的p-MDRV病毒载体,利用引物设计扩增获得同样含Sap1酶切位点的S组基因片段,扩增片段经SapI酶切后连接至病毒载体,获得感染性克隆质粒载体。鉴定结果显示插入p-MDRV病毒载体中的S组基因未发生突变,位置、方向正确,表明成功构建了 MDRVS组基因感染性克隆载体。结论:本研究明确了 MDRV强毒和弱毒S组基因及其编码蛋白的差异,并成功构建了 MDRV S组基因感染性克隆载体。研究结果为继续克隆构建MDRV L及M组基因、建立MDRV反向遗传系统提供了技术平台,也为深入开展MDRV致病和致弱的分子机理研究奠定良好基础。