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【背景】人核糖体蛋白L6(RPL6)其基因定位于12号染色体,2区4带1亚带,基因全长989bp,分子量33kD,编码288个氨基酸,有6个内含子和6个外显子。RPL6位于核糖体50S的大亚基中,定位于氨基酰-tRNA结合位点,肽酰转移酶中心区,与已知的23sRNA紧密结合,对肽酰转移酶活性有着重要的催化作用。在其蛋白质的表面,可能存在着与另外的核糖体成分交互作用的结合位点。如N-端与蛋白质和蛋白质的交互作用有关,而C-端则可能有RNA结合位点。RPL6广泛分布于人体全身各脏器组织,在核糖体的生成,转录和翻译过程中发挥着不可替代的作用。我们的前期研究发现,RPL6在胃癌耐药细胞中的表达明显高于其在胃癌细胞中的表达,进一步的研究表明RPL6可能通过上调Bcl-2和下调Bax抑制细胞凋亡而促进胃癌细胞的多药耐药。进一步的RT-PCR结果表明,RPL6在胃癌组织中的表达显著高于其在癌旁组织中的表达,由此提示,RPL6在胃癌的发生和发展中可能发挥着重要作用。既往的研究表明,核糖体蛋白在肿瘤的发生与发展中发挥着重要的作用。很多核糖体蛋白,如RPL14,RPS1,RPS7都分别在肿瘤中表达升高,与肿瘤的发生与发展密切相关。那么,RPL6在胃癌中的表达又是怎样的,其是不是与胃癌的发生与发展密切相关或是促进了胃癌的发生与发展呢,我们目前还不清楚,因此设计本实验,将对RPL6在胃癌中的表达及其功能研究进行探讨。【目的】1.探讨RPL6在胃癌组织和细胞中的表达。2.RPL6的正义真核表达载体pcDNA3.1及小干扰siRNA载体的构建及鉴定。3.进一步探讨RPL6在胃癌发生与发展中的作用及其进一步的分子机制。【方法】1.免疫组织化学观察RPL6在胃癌组织和非肿瘤正常胃粘膜组织中的表达,并对RPL6的表达与胃癌临床病理资料的关系进行统计学分析。2.Western blot方法检测RPL6在胃癌细胞系AGS,MKN45,SGC7901,MKN28和永生化的正常胃粘膜细胞GES中的表达。3.RPL6正义真核表达载体pcDNA3.1和小干扰siRNA载体的构建和鉴定,并通过脂质体法分别将RPL6的正义真核表达载体pcDNA3.1及小干扰siRNA载体转染入GES细胞,RPL6的小干扰siRNA转染入SGC7901细胞,通过G-418筛选获得稳定克隆。4.Western blot方法分别检测RPL6在上述转染细胞系的表达以观察不同载体的转染效果。5.MTT法绘制细胞生长曲线,观察RPL6的不同转染载体对细胞增殖的影响。6.流式细胞仪技术分析转染细胞的周期分布和周期进展。7.平板克隆形成实验观察不同载体的转染细胞在体外的克隆形成能力。8.裸鼠成瘤试验观察RPL6对胃癌细胞的体内成瘤能力的影响。9.Western blot方法检测RPL6在上述转染细胞中的周期相关分子(P16、P21、P27、CDK2和cyclinE)中的表达情况。【结果】1.探讨RPL6在胃癌组织和细胞中的表达。1) RPL6在60例胃癌原发灶细胞中的胞浆中表达,其阳性率可达到90%(50/60),明显高于非肿瘤胃粘膜组织25%(5/20),提示RPL6在胃癌组织中高表达(P<0.05)。2)进一步的统计学分析发现RPL6的过表达与患者的年龄和性别没有显著差异,而与肿瘤的分化程度,TNM分期及转移有明显差异(P<0.05)。3) RPL6在胃癌细胞系AGS,MKN45,SGC7901,MKN28中的表达明显高于永生化的正常胃粘膜GES细胞。RPL6在低等分化的胃癌细胞系AGS和MKN45中的表达分别高于中等分化的SGC7901和高等分化的MKN28细胞,提示RPL6的表达与肿瘤的分化程度密切相关,且与免疫组化的结果一致。2.RPL6的正义真核表达载体pcDNA3.1及小干扰siRNA载体的构建及鉴定。1)成功构建了RPL6的正义真核表达载体并证实其测序结果正确。2)成功构建了RPL6的小干扰siRNA载体并证实其测序结果正确。3.进一步探讨RPL6在胃癌发生与发展中的作用及其进一步的分子机制。1)构建了RPL6的正义真核表达载体pcDNA3.1和小干扰siRNA载体,并通过脂质体Lipofectamine2000分别将RPL6的正义真核表达载体pcDNA3.1及小干扰siRNA载体转染入GES细胞,RPL6的小干扰siRNA载体转染入SGC7901细胞,通过G-418筛选获得稳定表达的混合克隆,Western blot结果证实成功获得了RPL6表达上调和下调的稳定细胞系。2) MTT方法检测不同转染细胞系的细胞生长情况,结果显示上调RPL6表达的GES细胞,其生长速度明显加快,下调RPL6表达的GES细胞,其生长速度明显减慢;而下调RPL6表达的SGC7901细胞,其生长速度明显减慢。3)流式细胞周期分析不同转染细胞系的细胞周期分布和细胞周期进展,结果显示上调RPL6表达的GES细胞,其细胞增殖指数增加,细胞周期G1-S期转换加快,而通过siRNA下调RPL6表达的GES细胞,其结果相反;通过siRNA下调RPL6表达的SGC7901细胞,其细胞增殖指数减小,细胞周期阻滞在G1期。4)平板克隆形成实验结果显示,正义转染的GES细胞生长加快,且其体外克隆形成能力增强,明显高于对照组;而siRNA转染的GES和SGC7901细胞生长速度减慢,其体外克隆形成能力减弱,明显低于其对照组。5)裸鼠成瘤实验显示,siRNA转染的SGC7901细胞,其体内成瘤能力减弱,明显低于对照组。6) Western blot实验检测细胞周期相关蛋白质的表达情况变化,结果显示除了细胞周期蛋白cyclinE在不同转染的细胞系中有明显的差别外,其余的细胞周期相关蛋白,P16,P21,P27,CDK2在不同转染细胞系中没有明显的差别,且cyclinE与RPL6的变化一致。【结论】1.RPL6在胃癌组织和细胞中呈高表达,并与胃癌分化程度负相关,提示其参与胃癌的发生与发展。2.上调RPL6的表达可促进GES细胞的生长和细胞周期进展,体外克隆形成能力增强,下调RPL6的表达可抑制胃癌细胞的生长和细胞周期进展,体外克隆形成能力减弱及体内成瘤能力减弱,提示RPL6可作为胃癌治疗的新靶点。3.RPL6可能是通过调节cyclinE的表达而影响细胞周期进展,进而影响细胞的生物学行为,但分子机制尚需进一步的探讨。