研究背景：周围神经损伤是临床上常见的疾病,常常会影响患者的感觉及运动功能。神经损伤通常会导致部分神经缺损,缺损后的神经由于张力增加不能直接端端缝合。大量动物实验中,自体移植和异体移植一直被认为是治疗周围神经缺损的有效方法,但是因为取材所限,影响了其在临床上的广泛应用。近年来,随着移植免疫学研究的不断进步,关于异体神经移植的研究越来越受到人们的关注。众所周知,影响异种神经移植效果的最关键的因素是先天性免疫反应和获得性免疫反应(B细胞介导的体液免疫和T细胞介导的细胞免疫),其中T细胞介导的细胞免疫反应对其影响更为明显。新近研究证明Thl细胞、Th17细胞可通过其分泌的细胞因子在实体器官的移植中发挥重要的作用。Thl细胞、Th17细胞为两种不同的功能性CD4+细胞亚群,Thl细胞主要分泌IFN-γ,Th17细胞特异性分泌IL-17。Th22细胞是近年来新发现的一类辅助性T细胞,可通过分泌IL-22诱导STAT信号通路的活化。有研究表明,Th22细胞在皮肤移植后引起的急性排斥反应中发挥重要作用,但Th22在异种异体神经移植中的作用尚未明确。我们推测Th22细胞可能参与外周神经异种移植急性排斥反应的过程。Treg细胞可通过分泌一些细胞因子(TGF-p等)抑制Thl细胞、Th17细胞介导免疫反应来发挥免疫抑制功能,在维持机体免疫稳态及控制自身免疫病中起着重要作用。Foxp3是特异性表达在Treg细胞上的一类转录因子,对Treg细胞发育及免疫抑制功能起着很重要的作用。另外,TGF-β可抑制Th1、Th2细胞分化,却能促进Th9、Th17、Treg细胞的分化。TGF-β1和IL-6可促进Th17细胞的分化,抑制Treg细胞的分化,而TGF-β1和IL-6正相反。另有研究表明IL-6/STAT3和IL-2/STAT5分别是1h17、Treg细胞分化的关键因子。另外,IL-2能够诱导Treg细胞分化为Thl样细胞。由此可见Treg与Th1、Th17细胞分化之间具有可塑性特征。截止目前,尚未见有关Treg、Th22细胞在异种周围神经移植免疫排斥反应的相关报道,因此,它们在异种周围神经移植急性排斥反应过程中的作用尚未明确。本实验利用异种异体神经移植模型,探索Treg、Th22细胞生物学特性,并对Treg、Th22细胞在异种周围神经移植急性排斥反应中的作用进行研究。第一部分异种异体神经移植后早期免疫反应变化目的：1.研究异种异体神经移植后局部组织内单核细胞、Foxp3+细胞、IL-17+细胞、IL-22+细胞、IFN-y+细胞浸润程度。2.研究异种异体神经移植后局部组织内Foxp3、RORyt、AHR、T-bet mRNA表达水平。3.研究异种异体神经移植后脾细胞中Treg、Th17、Th22、Th1细胞比例变化规律。4.研究异种异体神经移植后血清中IL-17、IL-22、IFN-γ含量变化规律。5.研究异种异体神经移植后Treg与Th17/Th22/Th1及其分泌的IL-17、IL-22. IFN-γ的相关性。方法：100只健康6-8周C57雄性小鼠按随机数字表法分为对照组和实验组,每组50只,对照组小鼠行坐骨神经自体移植处理,而实验组进行异种异体移植,接受由雄性SD大鼠供给的坐骨神经。我们于术后第Id、3d、7d、14d、28d利用cat walk系统检测术后坐骨神经神经功能恢复情况,然后以取眼球法采集血标本离心获取血清,于-80℃超低温冰箱保存,采用ELISA法测定各组研究对象血清中IL-17、IL-22、IFN-γ的水平；用研磨法分离脾脏细胞并将细胞密度调整为1×106/ml,采用流式细胞术和荧光标记单克隆抗体检测各组研究对象各时相脾细胞中Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞、Th1(CD3+CD8-IFNy+)细胞、Th17(CD3+CD8-IL-17+)细胞、Th22(CD3+CD8-IL-22+)细胞的比例；另外取新鲜移植神经周围组织,抽提组织RNA,以RT-PCR检测移植神经周围组织内不同时相Foxp3、RORγt、AHR、T-bet表达水平；同时将获取的组织直接冷冻、切片,制成冰冻切片,应用免疫组化染色观察各组各时相移植神经周围组织内Foxp3+细胞、IL-17+细胞、IL-22+细胞、IFN-γ+细胞浸润情况,用H&E染色制成病理学标本观察移植神经周围组织内不同时相单核细胞的浸润程度；步骤按照操作指南进行。对两组之间结果进行比较,以Logistic回归分析方法分析Th17/Th1/Th22及其分泌的IL-17、IL-22、IFN-γ与Treg细胞之间的相关性。全部数据均用中位数描述,并利用Wilcoxon秩和检验进行统计学处理,应用Pearson或Spearman相关系数分析两组数据相关性,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.H&E染色结果显示对照组可见少量的单核细胞浸润,而且随着时间推移,单核细胞的浸润程度并无明显变化。与对照组相比,手术组术后各时间点可见大量单核细胞的浸润,明显多于对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。免疫组化染色结果显示异种异体神经移植组小鼠,在所有检测的时间点,均可观察到Foxp3+细胞、IL-17+细胞、IL-22+细胞、IFN-γ+细胞在移植神经周围组织内浸润,数量明显多于对照组,差异有统计学意义(p<0.05),呈现出时间依赖性特征。重要的是,异种异体移植神经周围组织内IL-17+细胞、IL-22+细胞、IFN-γ+细胞数量在28天内呈现出逐渐增多的趋势,而Foxp3+细胞的数量于术后第7天的时候达到高峰。另外,对照组可见少量的IL-17、IL-22、IFN-γ表达阳性细胞,而且随着时间推移,浸润程度也无明显变化。2.RT-PCR结果显示异种异体神经移植组小鼠,在所有检测的时间点,均可观察到移植神经周围组织内有Foxp3、RORγt、AHR、T-bet mRNA的表达,而且表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(p<0.05),并且呈现出时间依赖性特征。值得注意的是,异种异体移植神经周围组织内RORγt、AHR、T-bet mRNA的表达水平在28天内呈现出逐渐增高的趋势,而Foxp3于术后第7天的表达量最高。另外,对照组可见少量的Foxp3、RORγt、AHR、T-bet的表达,而且随着时间推移,表达水平也无明显变化。3.流式细胞仪检测结果显示Thl(CD3+CD8-IFNγ+)细胞、Th17(CD3+CD8-IL-17+)细胞在异种异体神经移植后第1天、3天、7天、14天明显升高,Tb22(CD3+CD8-IL-22+)细胞在异种异体神经移植后第7天、14天明显升高,而Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞在异种异体神经移植后第7天、14天明显降低,与对照组相比,差异有统计学意义(p<0.05)。4.ELISA检测结果显示异种异体神经移植组小鼠血中IL-17、IL-22、IFN-y水平在移植后第3天、7天、14天显著高于对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。5.进一步分析Treg细胞与Th17/Th1/Th22细胞及其分泌的IL-17、IL-22、IFN-γ的相关性,发现异种异体神经移植后第7天比例下降的Treg细胞与Th1/Th17/Th22细胞的比例存着明显负相关(P=0.028,P=0.005,P=0.004),与血清中IFN-γ、IL-17、IL-22含量呈负相关(P=0.003,P=0.029,P=0.047)。另外,异种异体神经移植后第14天Treg细胞亦与Thl7/Th1/Th22细胞比例及其分泌的IL-17、IFN-γ、IL-22含量呈明显负相关。结论：1.Treg细胞在小鼠外周神经异种移植急性排斥反应中起着重要的作用。2.Th17/Th22/Th1细胞及效应细胞因子IL-17、IL-22、IFN-γ参与小鼠外周神经异种移植急性排斥反应的发病过程。3.小鼠外周神经异种移植急性排斥反应中Treg细胞与Th17/Th22/Th1细胞及其分泌的IL-17、IL-22、IFN-γ呈负相关性。第二部分中和抗体对异种异体神经移植后早期免疫反应的影响目的：1.研究IL-17、IL-22中和抗体中和抗体对异种异体坐骨神经移植后局部组织内单核细胞浸润程度变化的影响。2.研究IFN-y、IL-17、IL-22中和抗体对异种异体坐骨神经移植后局部组织内Foxp3+细胞、IL-17+细胞、IL-22+细胞、IFN-y+细胞浸润程度变化的影响。3.研究IFN-y、IL-17、IL-22中和抗体对异种异体坐骨神经移植后局部组织内Foxp3、RORyt、AHR、T-bet mRNA表达水平变化的影响。4.研究IFN-γ、IL-17、IL-22中和抗体对异种异体坐骨神经移植后脾细胞中Treg、Th17、Th22、Thl细胞比例变化的影响。5.研究IFN-γ、IL-17、IL-22中和抗体对小鼠异种移植后神经功能恢复情况的影响。方法：150只健康6-8周C57雄性小鼠按随机数字表法分为IL-17中和抗体组、IL-22中和抗体组、IFN-y中和抗体组；每组均为异种异体移植小鼠,并接受雄性SD大鼠供给的坐骨神经。注意的是,小鼠于移植术前1天,腹腔注射中和IFN-γ、IL-17、IL-22抗体。我们于术后第1d、3d、7d、14d、28d利用catwalk系统检测术后坐骨神经功能的改变；然后处死小鼠,用研磨法分离脾脏细胞并将细胞密度调整为l×106/ml,采用流式细胞术和荧光标记单克隆抗体检测各组研究对象各时相脾细胞中Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞、Thl(CD3+CD8-IFNy+)细胞、Th17(CD3+CD8-IL-17+)细胞、Th22(CD3+CD8-IL-22+)细胞的比例；另外取新鲜移植神经周围组织,抽提组织RNA,以RT-PCR检测移植神经周围组织内不同时相Foxp3、RORyt、AHR、T-bet表达水平；同时将获取的组织直接冷冻、切片,制成冰冻切片,应用免疫组化染色观察各组各时程移植神经周围组织内Foxp3+细胞、IL-17+细胞、IL-22+细胞、IFN-γ+细胞浸润情况,用H&E染色制成病理学标本观察移植神经周围组织内不同时相单核细胞的浸润程度；步骤按照操作指南进行。对各组之间结果进行比较,全部数据均用均数±标准差或中位数描述,并利用Wilcoxon秩和检验进行统计学处理,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.Cat walk系统检测结果显示应用中和抗体后,异种异体神经移植的小鼠神经功能恢复明显优于单纯异种异体移植组。2.移植神经周围组织内不同时相单核细胞的浸润程度利可采用H&E染色检测,其结果显示,相对于单纯异种异体移植组,接受IL-17中和抗体、IFN-y中和抗体的异种移植小鼠在移植后第3天、7天、14天移植神经周围浸润的单核细胞数量明显下降；另外,IL-22中和抗体组中的异种异体移植小鼠在移植后第7天、14天移植神经周围单核细胞浸润程度也有显著降低,差异有统计学意义(p<0.05)。3.免疫组化染色结果显示：相对于单纯异种异体移植组,应用IFN-γ、IL-17、IL-22中和抗体后,异种异体移植神经周围浸润的IL-17+细胞、IL-22+细胞、IFN-γ+细胞的数量自移植后第6天明显降低；而Foxp3+细胞浸润程度却明显增加,并在第7天达到高峰。另外,我们发现应用IL-17中和抗体后移植神经周围Foxp3+细胞数量增加的程度明显高于其他中和抗体组。4.RT-PCR结果显示：应用IFN-y、IL-17、IL-22中和抗体之后,异种异体神经移植周围组织内RORyt、AHR、T-bet mRNA的表达水平下降,而且在移植后第7、14、28天均有所下降；另外,Foxp3的表达却增多,而且于移植后第7天表达水平最高。5.流式细胞仪检测结果显示：应用IFN-y、IL-17、IL-22中和抗体之后,异种异体神经移植小鼠脾细胞内Th1(CD3+CD8-IFNy+)细胞Th17(CD3+CD8-IL-17+)细胞、Th22(CD3+CD8-IL-22+)比例出现下降,而Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞比例出现升高；而且应用IL-17中和抗体后Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞比例增多更为明显。结论：1. IFN-γ、IL-17、IL-22中和抗体促进受损神经功能修复。2. IFN-γ、IL-17、IL-22中和抗体明显抑制异种异体移植神经周围炎症细胞浸润。3. IFN-γ、IL-17、IL-22中和抗体能够有效的抑制异种异体移植引起的急性排斥反应。