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第一部分:GM-CSF对子宫内膜损伤修复的作用和内膜细胞效应机制研究目的:探究GM-CSF对子宫内膜损伤修复的作用,明晰其对子宫内膜腺上皮和基质细胞的生物学效应及机制,为临床难治性薄型子宫内膜的新治疗探索提供理论依据。材料与方法:采用宫腔灌注90%乙醇建立子宫内膜损伤小鼠模型,通过HE染色观测小鼠子宫内膜厚度、免疫组化检测ki67表达评估细胞增殖、在体早期胚胎种植数目评估内膜容受性。在建立稳定的子宫内膜损伤小鼠模型后,对其行腹腔注射GM-CSF,观察子宫内膜修复再生及妊娠情况。向人原代子宫内膜腺上皮和基质细胞培养基中加入不同浓度GM-CSF后,通过Brd U检测子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞增殖,Transwell检测基质细胞迁移,从而探究GM-CSF对子宫内膜细胞增殖和迁移能力的影响。在子宫内膜腺上皮细胞中,通过Western Blot检测Akt信号通路中的p-Akt,c-Jun,p70S6K蛋白分子。Akt信号通路抑制剂(LY294002)被用来探究GM-CSF对子宫内膜腺上皮细胞的相关作用能否被抑制。研究结果:宫腔内灌注乙醇可以建立稳定的子宫内膜损伤小鼠模型,与对照侧的小鼠子宫内膜相比,受损侧表现为子宫内膜厚度变薄(342.1±30.2μm vs.215.1±32.4μm,p<0.05),腺细胞Ki67表达降低(IRS评分:11.7±0.2 vs.7.5±1.2,p<0.05)以及胚胎种植数减少(7.7±0.8 vs.3.2±1.1,p<0.01)。对子宫内膜损伤模式小鼠行GM-CSF腹腔注射后,对照侧和损伤侧相比,子宫内膜厚度(350.2±21.3μm vs.356.0±22.4μm,p>0.05)、腺上皮细胞中Ki67的表达(IRS评分:7.5±2.0 vs.7.1±1.8,p>0.05)以及胚胎种植数(6.2±0.5 vs.5.8±0.5,p>0.05)均未见显著差异,GM-CSF修复了受损的子宫内膜。GM-CSF促进人原代子宫内膜腺上皮细胞的增殖和基质细胞的迁移;在子宫内膜腺上皮细胞中,GM-CSF能激活p-Akt的磷酸化、增加p70S6K和c-Jun蛋白分子的表达量,上述GM-CSF对子宫内膜腺上皮细胞的作用可以被Akt信号通路抑制剂(LY294002)所抑制。结论:GM-CSF对宫腔灌注乙醇所致小鼠子宫内膜损伤可促进其再生修复,可促进人原代子宫内膜腺上皮细胞增殖和基质细胞迁移,激活Akt信号通路,为临床子宫内膜再生修复障碍所致薄型子宫内膜提供新的治疗思路。第二部分:GM-CSF促进血管再生的效应及机制研究研究目的:探究GM-CSF对血管再生的作用和机制,为临床子宫内膜损伤修复过程中的血管再生提供新的临床切入点。材料与方法:通过子宫内膜损伤小鼠模型评估血管生成因子CD31的表达,观察注射GM-CSF后是否促进血管生成;通过Sorafenib构建斑马鱼胚胎的体节间血管损伤模型,加入GM-CSF后观察是否促进血管修复。体外培养人脐静脉血管内皮细胞系HUVECs,检测不同浓度GM-CSF对HUVECs的再生作用。通过Ed U检测细胞增殖,通过Tube formation检测血管形成效应,通过划痕修复和Transwell实验检测细胞迁移作用;采用Real-time PCR技术验证差异表达m RNA、Western Blot验证差异表达蛋白、胞浆核蛋白分离Western Blot证实蛋白入核、Ch IP验证转录因子入核后调控相关DNA启动子的表达;通过FAK抑制剂(PF573228)和STAT3 si RNA分别抑制FAK和敲降STAT3,验证GM-CSF对HUVECs生物学行为的效应能否被抑制。研究结果:GM-CSF促进子宫内膜损伤小鼠模型中血管生成因子CD31的表达;GM-CSF对Sorafenib导致的斑马鱼胚胎体节间血管损伤模型具有修复作用。GM-CSF可促进HUVECs增殖和迁移,增加血管样网络结构的形成以促进HUVECs的血管生成。GM-CSF用药组中,HUVECs中血管形成相关基因VEGF,MMP2,Ang1,Ang2,Tie2的m RNA表达量显著增加;GM-CSF可以激活FAK/Src/ERK信号通路,增加p-FAK,p-Src,p-ERK 1/2,p-STAT3,p-p38 MAPK,p-c-Jun,p-CREB,p-Akt,p-e NOS的磷酸化表达量,增加下游VEGF和MMP2蛋白的表达。GM-CSF处理30 min后,可增加STAT3的表达量,促进STAT3从胞浆到胞核转运,从而调控下游VEGF和MMP2基因的表达。以上GM-CSF对HUVECs生物学行为的影响效应均可被FAK抑制剂(PF573228)和STAT3 si RNA抑制。结论:GM-CSF促进子宫内膜损伤小鼠模型和血管损伤斑马鱼模型的血管再生;GM-CSF可能通过激活FAK/Src/ERK信号通路,促进STAT3入核从而发挥对HUVECs的促增殖、血管生成和迁移作用,为临床治疗子宫内膜血管修复异常提供新的切入点。