研究目的挤压伤指的是躯干或四肢受到挤压,导致被挤压部位肌肉肿胀和/或神经功能失常。挤压伤多发生于地震、车祸等。挤压综合症则是指当挤压时间过长,被挤压部位肌肉大量坏死,当解除挤压后,大量的细胞内物质从坏死肌肉释放入血,导致代谢性酸中毒、高血K⁺症、以及其他代谢性紊乱。同时坏死的肌肉组织吸收大量的水分,导致水钠在局部潴留,从而引发低血容量性休克。挤压综合症患者如果不及时治疗,后期会出现肾衰竭。大地震时,挤压综合征的发生率约为2¹5%,是除了外伤以外导致死亡最主要的原因。高达20%的挤压综合症患者死因是高血K⁺症引起的心律失常或者低血容量性休克。但是因为院前挤压综合征的诊断比较难,临床缺乏降低挤压综合征患者早期死亡安全有效的药物。山莨菪碱是一种传统的抗休克药物,可以提高血液的微循环,临床上多用于治疗伴有血流障碍性的疾病,比如脓毒性休克和弥散性血管内凝血障碍。我们既往的研究发现山莨菪碱的抗休克作用主要是通过作用于M受体,使乙酰胆碱更多的和α7nAChR相结合,提高血压而不改变心率,从而发挥抗炎抗休克作用。胰岛素在临床上和葡萄糖合用,可以通过激活Na+/K⁺-ATPase促进血K⁺进入细胞而降低血K⁺浓度。有研究报道N受体激动剂尼古丁可以激活α7nAChR进而提高胰岛素的敏感性,那么山莨菪碱能否通过α7nAChR的激活用于挤压综合征的预防给药或者治疗呢?另外文献报道挤压伤发生时,高K⁺血症主要见于成年男性,而E₂可以降低血清K⁺浓度。E₂可以通过作用于胰岛素信号通路提高心肌细胞Na⁺/K⁺-ATPase的表达和活性。但是,挤压综合征中E₂和高K⁺血症,E₂和胰岛素敏感性的关系未见报道。本实验的目的在于通过一系列的实验探索:1、α7nAChR激活对挤压综合征死亡率的影响及其机制研究;2、E₂在α7nAChR激活对挤压综合征的预防作用中扮演的角色。研究方法1、山莨菪碱对挤压综合征大鼠死亡率及血生化和电解质指标的影响用SD大鼠制做挤压综合征模型。正常组:生理盐水;对照组:挤压+生理盐水;预防给药组:解除挤压前30min给予山莨菪碱;治疗给药组:解除挤压后1h给予山莨菪碱。解除挤压后观察SD大鼠24h死亡率。另外造模,解除挤压后6h眶静脉丛取血,静置、离心得到血清,检测血清K⁺、Na⁺、Cl^-、Scr、CK、CK-MB和BUN水平。2、山莨菪碱对挤压综合征大鼠胰岛素敏感性的影响用SD大鼠制做挤压综合征模型。正常组:生理盐水;对照组:挤压+生理盐水;预防给药组:解除挤压前30min给予山莨菪碱。解除挤压后6h眶静脉丛取血,静置、离心得到血清,检测血清胰岛素和葡萄糖水平。3、α7nAChR参与了山莨菪碱对挤压综合征死亡率、血清K⁺和胰岛素敏感性的作用工具药:α7nAChR激动剂PUN和抑制剂MLA。用C57BL/6小鼠制做挤压综合征模型。对照组:造挤压综合征模型并给予等量的生理盐水;预防给药组:解除挤压前30min给予山莨菪碱。MLA组:解除挤压前30min给予MLA;山莨菪碱+MLA:解除挤压前1h给予MLA,解除挤压前30min给予山莨菪碱;PUN组:解除挤压前30min给予PUN。解除挤压后观察C57BL/624h死亡情况。另外同样的五组,解除挤压后6h取血,静置、离心得到血清,检测血清K⁺,胰岛素和葡萄糖水平。同时检测正常小鼠血清K⁺,胰岛素和葡萄糖水平。4、用α7nAChR-/-小鼠验证α7nAChR参与了山莨菪碱对挤压综合征死亡率、血清K⁺和胰岛素敏感性的作用用α7nAChR+/+和α7nAChR-/-小鼠制做挤压综合征模型。野生型和纯合子各分为两组,对照组:造挤压综合征模型并给予等量的生理盐水;预防给药组:解除挤压前30min给予山莨菪碱。解除挤压后6h取血,静置、离心得到血清,检测血清K⁺,胰岛素和葡萄糖水平。另外同样的四组,解除挤压后观察24h死亡情况。5、山莨菪碱对高K⁺血症大鼠死亡率和血清K⁺的作用对照组:生理盐水,30min后给予KCl;实验组:给予山莨菪碱,30min后给予同样的KCl。30min后取血,检测血清K⁺浓度。同样的另外两组观察24h死亡情况。6、α7nAChR参与了山莨菪碱对细胞外高K⁺的作用成肌细胞分成五组:山莨菪碱组,乙酰胆碱组,山莨菪碱+乙酰胆碱组,尼古丁组和PUN组。在细胞培养基中加入外源性K⁺造高K⁺模型。给药时间在加入K⁺之前30min。K⁺加入6h后取培养基检测K⁺和葡萄糖浓度。同样的用n受体抑制剂Mec和除α7nAChR以外的N受体阻断剂hex探究α7nAChR的作用。7、胰岛素信号通路介导山莨菪碱降低细胞外高K⁺的作用HNMPA-（AM）3:胰岛素受体抑制剂。C2C12骨骼肌成纤维细胞分成五组:正常组,对照组,山莨菪碱+乙酰胆碱,HNMPA-（AM）3和山莨菪碱+乙酰胆碱+HNMPA-（AM）3组。免疫荧光检测HNMPA-（AM）3对Na⁺/K⁺-ATPase在细胞膜表面分布的影响。使用胰岛素受体抑制剂HNMPA-（AM）3、mTOR抑制剂雷帕霉素、pi3k抑制剂LY294002、转录活化因子Stat3抑制剂Stattic和Na⁺/K⁺-ATPase抑制剂哇巴因探究胰岛素/Na⁺/K⁺-ATPase通路对细胞外高K⁺的作用。8、挤压综合征死亡率、雌激素、胰岛素敏感性和血清K⁺的性别差异雌雄小鼠各半造挤压综合征模型,观察24h小鼠死亡情况。另外造模,解除挤压后6h取血,测量雌雄小鼠E₂、血清K⁺、胰岛素和葡萄糖水平。9、α7nAChR的激活对挤压综合征小鼠血清K⁺和E₂的影响工具药:α7nAChR抑制剂MLA。用C57BL/6小鼠制做挤压综合征模型。对照组:造挤压综合征模型并给予等量的生理盐水;预防给药组:解除挤压前30min给予山莨菪碱。MLA组:解除挤压前30min给予MLA;山莨菪碱+MLA:解除挤压前1h给予MLA,解除挤压前30min给予山莨菪碱。解除挤压后6h取血,静置、离心得到血清,检测血清K⁺浓度、胰岛素和葡萄糖水平。同时检测正常小鼠血清K⁺浓度、胰岛素和葡萄糖水平。10、卵巢摘除术对挤压综合征小鼠血清K⁺、E₂和胰岛素敏感性的影响假手术组和手术组各分成四组:正常组、挤压组、山莨菪碱组和E₂组。后三组均挤压。取血,检测血清K⁺和E₂水平。另外假手术组和手术组各再造模分组:挤压组、山莨菪碱组和E₂组。11、E₂对挤压综合征小鼠死亡率的影响假手术组和手术组各再造模分组:挤压组、山莨菪碱组和E₂组。监测解除挤压后24h死亡情况。12、探究山莨菪碱对挤压综合征大鼠血压的影响以及α7nAChR在其中发挥的作用SD大鼠分成五组:正常组、对照组、MLA组、山莨菪碱组和MLA+山莨菪碱组。后四组接受挤压。解除挤压前,各组先测量一段大鼠血压和心率,解除挤压后持续监测3.5h再停止测量。记录分析。实验结果1、和不给药组相比,解除挤压前30min和解除挤压后1h给予山莨菪碱可以显著降低挤压综合征大鼠24h死亡率以及挤压综合征大鼠血清K⁺、scr、ck、ck-mb和bun水平2、和不给药组相比,给予山莨菪碱可以提高挤压综合征大鼠胰岛素敏感性。3、山莨菪碱降低挤压综合征小鼠24 h死亡率的作用可以被α7nAChR抑制剂MLA阻断。而α7nAChR激动剂PNU可以显著降低挤压综合征小鼠24 h死亡率。PNU提高挤压综合征小鼠胰岛素敏感性,MLA降低挤压综合征小鼠胰岛素敏感性。4、山莨菪碱可以降低野生型挤压综合征小鼠24 h死亡率,但是对纯合子挤压综合征小鼠24 h死亡率没有显著作用。5、山莨菪碱预防给药可以通过降低血K⁺降低高血K⁺症大鼠死亡率。6﹑山莨菪碱单用、山莨菪碱和乙酰胆碱合用均可降低细胞外高K⁺和葡萄糖浓度。山莨菪碱和乙酰胆碱合用比山莨菪碱单用效果更明显。Mec和MLA可以阻断这一作用。尼古丁和PNU单用均可以降低细胞外高K⁺和葡萄糖浓度。7、山莨菪碱+乙酰胆碱使更多的Na+/K⁺-ATPase磷酸化,而胰岛素受体抑制剂HNMPA-（AM）3可以阻断这一作用。HNMPA-（AM）3、雷帕霉素、LY294002、Stattic和哇巴因可阻断山莨菪碱和乙酰胆碱降低细胞外高K⁺的作用。8、挤压综合征雌性小鼠和雄性小鼠死亡率差异无统计学意义,但是挤压以后雌性小鼠血清K⁺低于雄性小鼠,E₂水平高于雄性小鼠,胰岛素敏感性高于雄性小鼠。9、α7nACh R的激活可以降低挤压综合征小鼠血清K⁺浓度及提高血清E₂的浓度。10、卵巢摘除术可以提高挤压综合征小鼠血清K⁺浓度,降低胰岛素敏感性,降低血清E₂浓度。11、E₂可以降低挤压综合征小鼠死亡率。12、山莨菪碱升高挤压综合征大鼠血压,MLA可以阻断山莨菪山莨菪碱的这一作用。山莨菪碱对挤压综合征大鼠心率没有影响。研究结论:α7nAChR的激活可以降低挤压综合症早期死亡率,这种作用部分是通过胰岛素/Na+/K⁺-ATPase信号通路介导的血K⁺降低来实现的,并且雌激素在其中发挥重要作用;部分作用可能是通过升高血压来实现的。激活α7nAChR的药物（如山莨菪碱）以及E₂,有望成为降低挤压综合症早期死亡率的有效药物。