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到目前为止,预防和控制传染病传播的最好方法仍然是疫苗接种。传统减毒活疫苗虽然能诱导机体产生长效的免疫反应,但可能会引起不符合预期的副作用。而亚单位疫苗虽然安全性高,但往往不能刺激机体产生有效的细胞免疫效应,因此,在疫苗的研发中,需要免疫刺激因子来提高疫苗的免疫效力。基于纳米技术的抗原展示已经发展成为一种疫苗策略,抗原展示颗粒已被证明可以有效地提高抗原的免疫原性。然而,抗原展示的准确方法,特别是在同一颗粒上同时展示多个抗原的方法,仍然是近年来科学家们需要解决的一个难题。多肽（Peptide）由于其亲和力高、分子量小、无免疫原性、易合成、安全性好、表面密度高、生产成本低等优点,具有广阔的应用前景。近年来,合成多肽作为特异性的生物识别配体被深入研究,并在医学治疗、靶向给药、蛋白纯化等方面得到了广泛的应用。分子对接技术（Molecular Docking Technology）的发展,为设计具有新活性以及高亲和性的多肽提供了强有力的支持。多肽的高亲和力和其靶向性也为多肽介导的抗原展示提供了新的可能。本研究为了验证虚拟筛选获得的亲和多肽在建立抗原展示纳米颗粒体系方面的应用潜能,通过SYBYL-X2.1.1软件实施分子对接辅助试验手段,分别对能够靶向猪瘟病毒E2蛋白（Classical Swine Fever Virus E2 protein,CSFV E2）和猪圆环病毒2型衣壳蛋白（Porcine Circovirus 2 Capsid protein,PCV2 Cap）的亲和多肽进行设计、筛选与鉴定。以聚乳酸-羟基乙酸聚合物（PLGA）和革兰氏阳性增强基质（GEM）纳米颗粒为颗粒载体,通过亲和多肽与靶标蛋白的高亲和力,建立了抗原展示纳米颗粒体系,并对制备好的抗原展示纳米颗粒的免疫学活性进行了鉴定。具体内容如下:1.靶向CSFV E2蛋白和PCV2 Cap蛋白的亲和多肽设计对蛋白质结构数据库（Protein Data bank,PDB）中PCV2 Cap的蛋白晶体结构,以及利用SWISS-MODEL网站根据牛流行性腹泻病毒E2蛋白（Bovine Viral Diarrhea Virus E2 protein,BVDV E2）同源建模而来的CSFV E2晶体结构进行分析,并根据需要选择合适的对接活性口袋。利用SYBYL-X2.1.1软件,采用逐个延长的模式,建立长度为2-9个氨基酸的线性多肽库。再用SYBYL-X2.1.1中的Surflex-Dock程序对蛋白晶体结构上的活性口袋与多肽库实施分子对接。对接的结果通过一致性评分函数CScore来评价,综合评分显示为一个Total＿Score值。再通过Create/MOLCAD模块生成多肽与蛋白的不同分子溶剂表面,分析多肽与蛋白之间的相互作用。最终,筛选出48条靶向CSFV E2和55条靶向PCV2 Cap的多肽序列进行合成,进行后续的试验验证。2.靶向结合CSFV E2和PCV2 Cap蛋白的最佳多肽筛选通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和表面等离子共振试验（SPR）对合成多肽与蛋白的亲和力和特异性进行鉴定。共筛选出性能较好的靶向CSFV E2的优势多肽5条,E2-PL15、E2-PL16、E2-PL17、E2-PL22、E2-PL23,其平衡解离常数（KD）分别为141 n M、6.74μM、705 n M、3.38μM和90.1 n M;靶向PCV2 Cap的优势多肽4条,Cap-PL4、Cap-PL5、Cap-PL8、Cap-PL16,其KD值分别为412.9n M、105.3 n M、790.2 n M和650.8 n M,说明所有多肽与蛋白均产生了较好的亲和反应。最后,我们将优势多肽分别偶联到NHS琼脂糖磁珠上,验证不同多肽对靶标蛋白结合的能力,筛选出了能够在同样条件下结合蛋白最多的亲和多肽E2-PL23和Cap-PL5。3.多肽与蛋白结合的最适条件多肽与蛋白是通过非共价键发生相互作用的,溶液环境的改变会导致多肽与蛋白之间的亲和力增强或下降,因此需对多肽结合蛋白的最适条件进行筛选。通过改变PBS溶液的p H浓度、盐离子浓度等条件,对E2-PL23和Cap-PL5与其靶标蛋白相互作用的最适结合溶液环境进行了检测,结果表明E2-PL23在p H6.0-10.0范围内、Na Cl浓度为0.1-0.2 M的PBS缓冲液中与CSFV E2结合最好;Cap-PL5与PCV2 Cap在p H 8.0-9.0、Na Cl浓度为0.2-0.3 M的PBS缓冲液中结合最好。4.建立抗原展示纳米颗粒体系作为特异性的生物识别配体,亲和多肽能够通过与靶标蛋白结合,完成许多生物学功能。基于亲和多肽结合蛋白的特异性,本研究建立了一种能够精确展示蛋白抗原的纳米颗粒抗原展示体系。首先,确定了E2-PL23结合CSFV E2以及Cap-PL5结合PCV2 Cap的具体位置,这对于抗原的精确展示非常重要。通过突变计算机模拟的与多肽结合的蛋白关键位点,并鉴定多肽与突变蛋白之间的亲和力,确定了E2-PL23与CSFV E2结合的关键位点为Asn-997和Tyr-999;Cap-PL5与PCV2 Cap结合的关键位点为Arg-181和Gln-183。其次,通过EDC/NHS法将多肽与PLGA和GEM偶联,再与蛋白共同孵育,构建抗原展示纳米颗粒,经表征,我们成功构建了4种单抗原展示纳米颗粒PLGA-E2、PLGA-Cap、GEM-E2、GEM-Cap和两种多抗原展示纳米颗粒PLGA-E2+Cap和GEM-E2+Cap。随后检测了抗原展示纳米颗粒对APC细胞的毒性、摄取作用以及细胞因子的表达量的影响。结果表明,PLGA颗粒组（包括PLGA、PLGA-E2、PLGA-Cap和PLGA-E2+Cap）和GEM颗粒组（包括GEM、GEM-E2、GEM-Cap和GEM-E2+Cap）均对APC细胞无毒性,且在高浓度条件下,GEM颗粒组能够促进巨噬细胞生长。且PLGA颗粒组与GEM组均能够促进巨噬细胞的吞噬作用,并且能够在不造成炎性损伤的情况下促进APC细胞的炎性作用,促进树突状细胞的分化与成熟。最后,用带有同样抗原蛋白量的抗原展示纳米颗粒免疫小鼠,测定免疫后小鼠血清中的抗体及中和抗体水平,结果表明,我们制备的抗原展示纳米颗粒能够刺激小鼠产生相较于抗原蛋白更高的抗体水平与中和抗体水平,因此。具有优秀的免疫学活性。综上所述,基于分子对接技术,筛选具有新活性亲和多肽的方法是非常可靠的,筛选出的亲和多肽具有高亲和力和特异性,且在组装抗原展示纳米颗粒等应用上取得了很好的效果。这为亲和多肽在亚单位颗粒疫苗的研发提供了新思路。此外,我们多肽介导的抗原展示纳米颗粒还实现了在同一纳米颗粒上展示多种抗原,为多联疫苗的研发提供了支持。