近年来,国内外多家新生儿重症监护病房(neonatal intensive care unit, NICU)报道足月儿与近足月儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome, RDS)患病率明显上升,且具备不同于早产儿RDS的临床特征,足月儿与近足月儿RDS的病因、发病机制、预防和治疗方法受到越来越多新生儿科医师的重视。有文献报道[4-6],肺液吸收障碍可能直接影响新生儿进行正常气体交换或者通过影响肺表面活性物质的分泌和功能而间接导致新生儿RDS的发生,而肺泡上皮细胞是胎儿出生前后控制其肺液分泌和重吸收的主要开关。肺泡上皮细胞的钠水转运系统由上皮钠离子通道(epithelial sodium channel, ENaC)、Na+-K+-ATP酶(NKA)和水通道蛋白(AQP)等组成,其中ENaC在肺液主动重吸收中发挥最关键的作用[4,7-10]。α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC为ENaC的三个亚单位,在肺泡上皮细胞中均有其mRNA表达,其中以α-ENaC mRNA表达量最高,在钠离子转运过程中可能发挥最重要的作用。据报道,将小鼠的α-ENaC基因敲除后,其肺液无法在围生期内清除干净,大多于生后40小时内出现呼吸窘迫症状进而死于呼吸衰竭;而另外两种亚型或水通道蛋白(aquaporin, AQP)基因敲除的小鼠,虽然肺液清除的速度有所减慢,但仍可将肺液清除干净。因此,α-ENaC为肺液经由肺泡上皮细胞进行电解质转运的关键部分,其表达量和活性降低可能因肺液吸收障碍而导致RDS的发生[4,5]。如果α-ENaC通过影响新生儿肺液吸收及肺表面活性物质活性而在RDS的发病机制中起重要作用,那么编码α-ENaC的基因SCNN1A则可能是RDS的重要易感基因。SCNN1A基因多态性可能通过影响α-ENaC mRNA表达量和活性而与RDS相关。携带突变等位基因的患儿可能在整个围产期通过抑制α-ENaC mRNA的表达和功能而影响肺液的清除及肺表面活性物质的活性,最终导致RDS的发生。这是迄今为止首例从肺液吸收的角度研究遗传基因与RDS发病相关性的研究。本课题拟对不同胎龄RDS患儿进行肺表面活性物质疗效比较,以期观察是否外源性肺表面活性物质替代治疗对所有RDS患儿都有效,对前期提出的近足月／足月儿RDS病因可能不同于早产儿的设想进行临床验证。并利用HapMap数据库和单体型相结合的方法,对SCNN1A基因所有SNP位点进行分析,并从中挑选出与新生儿尤其是近足月/足月儿RDS发病密切相关的标志性SNP位点。同时通过检测不同胎龄正常新生儿和RDS患儿鼻腔上皮a-ENaC mRNA相对表达量,进一步验证携带易感基因型的新生儿与a-ENaC mRNA表达及RDS发病之间的关系。材料与方法1.不同胎龄RDS新生儿肺表面活性物质替代治疗疗效比较1.1研究对象收集2010年1月至2013年2月在第三军医大学大坪医院儿科NICU住院治疗的168名RDS患儿,均接受外源性肺表面活性物质替代治疗。经过进一步筛选,最终入选135名RDS患儿,所有研究对象均为中国籍汉族。根据胎龄将其分为3组：组1(早产儿组)：胎龄<35周(n=54)；组2(近足月儿组)：35周≤胎龄<37周(n=35)；组3(足月儿组)：胎龄>37周(n=46)。1.2资料采集收集入组患儿基线资料数据(出生体重、性别、分娩方式、5 min Apgar评分)、RDS病情严重程度、用肺表面活性物质前和用肺表面活性物质后6小时血气分析(pH、PaO2、PaCO2)及氧合参数(FiO2、OI、PaO2/PAO2)结果、插管率、机械通气时间、住院时间、肺表面活性物质重复使用率。1.3统计分析采用SPSS16.0软件进行统计。率的比较用卡方检验；用药前后各指标比较用配对资料T检验；计量资料符合正态分布的用单因素方差分析；计量资料不符合正太分布的用非参数检验,以中位数(median)表示。P<0.05表示差异显著。2. SCNN1A基因多态性与新生儿RDS的关联性研究2.1研究对象标本收集时间为2012年1月至2014年12月。正常对照组血液标本来源于重庆市区及周边区县80家医院的产科病房,在新生儿出生时提取其脐带血；RDS组血液标本来源于第三军医大学大坪医院儿科NICU病房,取患儿股静脉血。最终129名正常新生儿、120名RDS患儿为本实验研究对象,所有研究对象均为中国籍汉族。2.2标签单核苷酸多态性的筛选2.2.1通过HapMap数据库,获得中国汉族人群SCNN1A全基因内最常见的SNP位点；2.2.2利用Haploview4.0软件在SCNN1A基因内构件单倍域；2.2.3结合参考文献挑选本实验要检测的tagSNP位点。2.3基因组DNA提取后利用iMLDR法对SCNN1A基因型进行检测2.4统计分析采用SPSS16.0软件进行统计。基线资料中计量资料采用独立样本T检验,率的比较用卡方检验：各SNP位点分布是否符合Hardy-Weinberg定律、RDS与SCNN1A基因多态性的相关性、RDS病情严重程度与SCNN1A基因多态性的相关性以及不同胎龄RDS与SCNN1A基因多态性的相关性均采用卡方检验。利用Logistic回归进行校正胎龄、出生体重和性别后RDS与SCNN1A基因多态性的相关性分析。P<0.05表示差异显著。3.α-ENaC mRNA表达水平分析及其与RDS相关性的初步研究3.1研究对象收集2014年5月至2015年5月在第三军医大学大坪医院儿科NICU住院治疗的57例新生儿,排除9例不合格样本,最终将48例患儿作为本实验研究对象,其中正常新生儿26例,RDS患儿22例。所有研究对象均为中国籍汉族。3.2利用荧光定量PCR检测α-ENaC mRNA的相对表达量(POLR2A基因作为内参,详见第四章方法部分)。3.3基因组DNA提取后利用iMLDR法对SCNN1A基因型进行检测。3.4统计分析采用SPSS16.0软件进行统计。基线资料中计量资料采用独立样本T检验,率的比较用卡方检验；不同组别新生儿鼻腔α-ENaC mRNA相对表达量的比较采用独立样本T检验或单因素方差分析；对α-ENaC mRNA相对表达量进行ROC曲线绘制及曲线下面积(AUC)的计算和分析。H-W平衡采用卡方检验。线性回归分析评估基因型与α-ENaC mRNA相对表达量的相关性。P<0.05表示差异显著。结果：1.不同胎龄RDS新生儿肺表面活性物质替代治疗疗效比较1.1用肺表面活性物质前后血气结果比较：用肺表面活性物质前三组患儿间PH值、PaO2、PaCO2差异均无统计学意义(P>0.05)；给予肺表面活性物质气管内滴入治疗后六小时,胎龄<35周早产儿组血气指标明显改善：PH值、Pa02较治疗前显著上升,PaCO2较用药后显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)；35周≤胎龄<37周的近足月儿组3项血气指标均无明显改善(P>0.05)；而胎龄≥37周的足月儿组在用药后6小时血气指标不仅无明显改善,反而较用药前更糟糕：PH值无显著变化(P>0.05), PaO2显著降低、PaCO2显著升高(P<0.05)。1.2用肺表面活性物质前后氧合参数比较：用肺表面活性物质前三组患儿间FiO2、OI、PaO2/PAO2差异均无统计学意义(P>0.05)；用肺表面活性物质治疗6小时后,胎龄<35周早产儿组氧合参数较用药前明显改善：FiO2显著降低(P<0.05),PaO2/PAO2显著升高(P<0.05),OI值无显著变化(P>0.05)；而胎龄≥35周的近足月和足月儿组在用药后氧合参数不仅无明显改善,甚至较用药前更糟糕：FiO2和OI值均显著升高(P<0.05),PaO2/PAO2无显著变化(P>0.05)。1.3治疗结局：三组患儿气管插管率、机械通气时间以及存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)；而住院时间和肺表面活性物质重复使用率差异有统计学意义(P<0.05)。随着胎龄的增加,住院时间逐渐缩短,而肺表面活性物质重复使用率明显增加。2. SCNN1A基因多态性与新生儿RDS的关联性研究在总样本中,x2检验和logistic回归分析结果均提示仅位点rs4149570多态性与新生儿RDS发病密切相关(P<0.05),其中AA基因型是RDS发病的高危因素。亚组分析结果提示,在胎龄大于37周的亚组中,除了SNP位点rs4149570,位点rs7956915多态性也与RDS发病相关(P<0.05),两个位点均提示仅突变基因型(AA)是新生儿RDS发病的高危因素；有趣的是,在胎龄小于37周的两个早产儿亚组中,未发现与新生儿RDS发病相关的SNP位点(P>0.05)。此外,在总样本中,根据RDS严重程度将RDS患儿分为4组,之前得到的两个阳性SNP位点(rs4149570和rs7956915)均与RDS严重程度相关性无统计学意义(P>0.05)。3. α-ENaC mRNA表达水平分析及其与RDS相关性的初步研究3.1鼻腔上皮α-ENaC mRNA相对表达量(内参基因POLR2A)检测结果RDS患儿α-ENaC mRNA相对表达量显著低于正常新生儿,差异有统计学意义(P<0.05)。正常新生儿中,胎龄<35周组α-ENaC mRNA相对表达量显著低于胎龄≥35周组,差异有统计学意义(P<0.05)；35周≤胎龄<37周组α-ENaC mRNA相对表达量均值也低于胎龄≥37周组,但差异无显著统计学意义(P>0.05)。然而在RDS患儿中,不同胎龄的3组患儿间α-ENaC mRNA相对表达量并无显著统计学差异(P>0.05)。3.2 α-ENaC mRNA在RDS诊断中的意义ROC曲线下面积(AUC)为0.950,P=0.000,说明α-ENaC mRNA相对表达量对RDS的诊断有意义。当α-ENaC mRNA的相对表达量取截断值0.82时,其灵敏度为100%,特异度为77.3%,诊断准确指数为0.773。3.3 SCNN1A基因SNP位点(rs4149570, rs7956915)与α-ENaC mRNA表达相关性分析将基因分型结果与α-ENaC mRNA相对表达量进行线性回归分析,结果提示：在RDS组中,位点rs4149570多态性与α-ENaC mRNA表达量呈显著线性相关(P<0.05)；突变型(AA)的α-ENaC mRNA表达量显著低于野生型(CC)和杂合型(CA)(P<0.05)。而位点rs7956915多态性与α-ENaC mRNA表达量无显著线性相关关系(P>0.05)。结论：1.外源性肺表面活性物质替代治疗对于胎龄小于35周的早产儿RDS疗效更佳,而近足月／足月儿并未取得同等疗效；近足月／足月儿可能存在不同于早产儿RDS的病因和发病机制。2. SCNN1A基因rs4149570和rs7956915位点多态性可能是中国汉族新生儿尤其是足月儿RDS发病的重要易感因素,但与RDS严重程度无相关性。3.正常新生儿鼻腔上皮α-ENaC mRNA表达量受胎龄的调控,随着胎龄的增加,其表达量逐渐增加；而RDS患儿α-ENaC mRNA表达量与胎龄不相关,且显著低于正常新生儿α-ENaC mRNA表达量。新生儿鼻腔上皮a-ENaC mRNA的相对表达量(内参基因P0LR2A)低于0.82可作为临床预测RDS发病风险性的参考指标,对明确呼吸窘迫症状患儿病因及指导其治疗方案的制定具有重要意义。4. SCNN1A基因rs4149570位点多态性与α-ENaC mRNA表达量呈显著线性相关,携带突变基因型(AA)的患儿可能在整个围产期通过抑制α-ENaC mRNA的表达量而影响肺液的清除或肺表面活性物质的活性,最终导致RDS的发生。5.下一步本课题将在更大的样本量中利用深入测序技术进一步探测SCNN1A基因中常见突变和罕见突变与RDS的相关性,并用目前处于国际前沿水平的肺部超声技术对此类患儿因肺液吸收障碍导致RDS予以验证；并对α-ENaC影响肺表面活性物质活性以及糖皮质激素通过上调α-ENaC mRNA的表达量而促进新生儿肺液吸收的具体机制进行深入研究,为新生儿尤其是近足月／足月儿RDS的救治提供新的思路。