颗粒细胞位于卵泡内,介于膜细胞和卵子之间,可将膜细胞合成的雄激素转化为雌二醇,连同其分泌其他生长因子和营养物质在促进卵子发育的过程中发挥重要作用。一旦颗粒细胞发育不良可直接导致动物繁殖性能下降。LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分,可直接作用于颗粒细胞并影响其功能,并且严重影响动物繁殖性能。为深入探讨LPS对猪颗粒细胞发育和功能的影响,本论文主要探索了猪颗粒细胞体外分离培养的新方法,并在此基础上开展了LPS对颗粒细胞活力的影响及其分子调控机制的研究。1.颗粒细胞的纯化为解决目前通过直接抽取卵泡液的方式获得的猪颗粒细胞贴壁率低,活力差的问题,本研究在抽取方式基础上采用FICOLL分离液对细胞进一步纯化,并利用Western Blot、免疫荧光染色和ELISA等方法分别对纯化的猪颗粒细胞进行了相关主要指标的鉴定。结果发现经FICOLL纯化的猪颗粒细胞贴壁能力强、形态饱满,立体感强;获得的猪颗粒细胞表达FSHR及E2和P4分泌相关CYP11A1、CYP19A1、LHCGR、St AR等基因。且纯化后的猪颗粒细胞E2分泌量显著提高,而P4分泌显著降低。该结果表明经过纯化的猪颗粒细胞更加符合体外试验对颗粒细胞的要求。2.LPS促进猪颗粒细胞增殖分子机制前期研究发现LPS能够引起猪颗粒细胞产生炎性反应并抑制E2分泌。然而,LPS对猪颗粒细胞活力的影响及分子机制仍然未知。在本研究中,采用纯化的猪颗粒细胞通过CCK-8、细胞流式检测、Western Blot、基因定量检测等方法,揭示经LPS处理后猪颗粒细胞的活力其潜在的分子机制。结果发现添加LPS(500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml)处理猪颗粒细胞24h可促进细胞增殖和TNF-α分泌;为证明TNF-a是否介导LPS促进猪颗粒细胞增殖,我们利用TNF-α剪切酶抑制剂ADAM17和单独添加重组TNF-α(5ng/ml、10ng/ml)处理。结果显示ADAM17可以显著抑制LPS的促增殖作用;而单独添加重组TNF-a可以得到和LPS相同的结果。该结果证明TNF-a介导了LPS对猪颗粒细胞增殖的促进作用。为进一步探究其分子机制,我们发现用LPS或重组TNF-α处理,猪颗粒细胞中Serpin E1和Serpin B2的表达显著上调,并且细胞中ERK1/2磷酸化水平显著升高。而阻断ERK1/2磷酸化则可降低LPS和TNF-α导致的猪颗粒细胞增殖和Serpin E1和Serpin B2表达增加。进一步的si RNA试验发现通过敲低LPS或重组TNF-α诱导的Serpin E1或Serpin B2基因的表达可以完全抑制猪颗粒细胞增殖。此外我们发现LPS或重组TNF-α处理可提高猪颗粒细胞中的线粒体膜电位(MMP)极化,并增加ATP水平。综上所述,本研究通过FICOLL-Paque分离液纯化的猪颗粒细胞活力更好且更能体现出颗粒细胞的特性,因此更加符合猪颗粒细胞的体外研究。我们发现LPS能够促进猪颗粒细胞增殖可能通过TNF-α介导ERK1/2通路上调Serpin E1和Serpin B2表达来实现,而LPS诱导的颗粒细胞MMP的极化可能协同影响这一过程。