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结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC )是世界范围内常见的实体肿瘤之一,严重威胁人类的健康。我国2000年至2011年结直肠癌的发病率和死亡率均逐年上升,据国家癌症登记中心公布的最新数据表明,2015年我国结直肠癌共发病37.63万人,死亡19.10万人。目前手术切除仍然是根治结直肠癌的主要手段,但大部分晚期结直肠癌患者或术后复发转移的结直肠癌患者,失去手术治疗的机会,积极地内科治疗是抑制肿瘤生长和延长生命的首选方法。结直肠癌的抗血管生成治疗在内科治疗当中具有举足轻重的地位。因此进一步探索结直肠癌血管生成的机制,寻找抗血管生成的有效靶点具有重要的理论意义和潜在的临床价值。富亮氨酸 α-2 糖蛋白 1 ( Leucine-rich-alpha-2-glycoprotein 1,LRG1 )是 1977 年发现的,在血液中和组织中表达的蛋白。近年来,研究发现LRG1在呼吸系统、消化系统和妇科肿瘤中的表达升高,且与肿瘤的恶性程度相关;也有研究发现LRG1促进肿瘤和其他疾病中的新生血管形成。但LRG1在结直肠癌发生发展和血管生成中的研究较少。基于以上研究背景,本课题通过临床大样本验证,探索LRG1在结直肠癌发生发展和血管生成中的作用,并通过体外细胞实验和体内成瘤实验进一步验证LRG1的促血管生成能力。最后通过信号通路研究,尝试揭示LRG1促进血管生成功能的相关作用机制。实验方法1.临床样本验证:收集中国人民解放军总医院2005年至2009年接受根治性手术治疗的III期结直肠癌的癌和癌旁标本,建立组织芯片和临床信息数据库。应用免疫组织化学染色技术检测LRG1、CD34-微血管密度(Micro-vessel Density, MVD ),分析LRG1与临床病理特征和患者预后的相关性,分析LRG1是否是影响患者生存的独立预后因素。分析LRGI与MVD-CD34的关系,判断LRG1对血管生成的影响。2. LRG1影响结直肠癌血管生成的体外研究:利用慢病毒构建基因过表达基因敲降稳转细胞株。通过Transwell侵袭实验和划痕试验检测LRG1对各稳转癌细胞株的侵袭和迁移能力的影响;并通过MTT实验、Transwell迁移实验和小管形成实验判断LRG1对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC )的增殖、迁移和成管能力的影响。3. LRG1影响结直肠癌血管生成的体内研究:利用过表达和对照细胞株建立裸鼠皮下成瘤模型。测量瘤体体积变化,第30天取出瘤体称重,并制作组织切片进行HE染色、CD34和VEGFA检测,判断LRG1对体内血管生成的影响。4. LRG1促进结直肠癌血管生成机制的初步研究:检测LRG1过表达和敲降细胞株VEGFA的表达和分泌VEGFA的水平;检测PI3K/AKT和MEK/ERK通路相关分子蛋白水平;检测HIF-1α细胞质和细胞核内的分布情况,判断LRG1是否介导HIF-1a移位入核发挥转录因子作用;检测在信号通路抑制剂作用下,细胞中VEGFA表达水平是否改变,以及HUVECs成管能力是否下降,进一步确认LRG1通过AKT、ERK双通路激活VEGFA诱导血管生成。实验结果:1.共312例Ⅲ期结直肠癌患者纳入本课题。免疫组化染色结果显示60.9%病例癌组织内LRG1高表达,只有11.9%患者的癌旁正常组织内LRG1高表达,LRG1在癌组织内表达水平高于癌旁正常组织(X2=35.412, P < 0.001 )。单因素分析显示LRG1与肿瘤分化较差、T4分期和血管浸润明显相关(P=0.035,0.028,0.007)。多因素分析显示LRG1是影响312例Ⅲ期结直肠癌患者总生存OS和无疾病生存的独立预后因素(HR=1.517, P=0.020;HR=1.754,P=0.013)。并且 LRG1 水平与肿瘤 MVD 正相关(t=-8.603,P<0.001)。2.选择LRG1表达最低的DLD1和表达量最高的HT29细胞系,分别建立LRG1过表达和敲降细胞株。Real-Time PCR证实过表达组LRG1的转录水平升高6.7倍,敲降组与对照组相比LRG1转录水平下降了 35%～96%。体外实验证明LRG1促进癌细胞的侵袭和迁移。进一步利用共培养HUVECs细胞进行体外功能实验,LRG1基因过表达表达促进血管内皮细胞的细胞增殖,迁移和成管功能(P<0.01)。3.裸鼠成瘤模型的肿瘤生长曲线显示LRG1促进裸鼠体内移植瘤生长(P<0.01 )。过表达组瘤体平均重量大于对照组(P<0.05)。瘤体制成组织切片并进行HE染色,结果发现过表达组的移植瘤浸润肌层,LRG1促进肿瘤的生长和浸润。CD34-MVD和VEGFA荧光染色证明过表达组促进为血管形成和VEGFA表达。4.DLD1细胞中过表达组与对照组相比VEGFA表达和分泌水平均升高;HT29细胞中敲降组和对照组相比VEGFA表达和分泌水平下降。Western Blot结果显示LRG1促进 PI3K/AKT/HIF-1α 和 Ras/MEK1/ERK1/2 通路的激活。并且 LRG1 诱导 HIF-1α从细胞质移位至细胞核。利用通路抑制剂分别抑制AKT和ERK通路后,DLD1-LRG1组的VEGFA表达量均有所下降,且LRG1诱导内皮细胞的小管形成能力被抑制。结论LRG1在结直肠癌肿瘤组织内高表达,且其表达水平明显高于对应癌旁正常组织。并与结直肠癌的T分期、分化程度和血管浸润明显相关。LRG1是影响结直肠癌OS和DFS的独立预后因素。LRG1与MVD成明显的正相关。LRG1不仅能够促进肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,且能够促进血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力。体内成瘤实验证明LRG1促使移植瘤向肌层浸润,也使CD34-MVD和VEGFA表达增加。肿瘤细胞中LRG1可通过PI3K/AKT/HIF1α和MEK/ERK双通路上调VEGFA分泌介导的血管生成。