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前言粒细胞集落刺激因子(Granuloctye colony-stimulating factor,G-CSF)是可以应用于临床的生长因子之一,目前在对人类缺血性卒中的应用研究已经进入临床Ⅰ/Ⅱ期阶段。尽管许多报道显示,G-CSF可减轻脑缺血动物模型的神经损伤,但对糖尿病合并的脑缺血是否同样有作用,目前尚未见报道。糖尿病合并脑梗死易给患者造成较严重的神经功能缺损,神经细胞凋亡是其重要的病理环节,抑制凋亡的发生可以减轻神经损伤。研究表明,G-CSF可以通过血脑屏障,与神经元膜上的受体G-CSF-R结合,在中枢神经系统发挥重要作用,与许多神经系统疾病有密切关系,而且它能动员骨髓干细胞向神经干细胞定向分化。其作用机制可能包括:抗凋亡,抗炎症,促进血管生成及促进神经祖细胞分化等多种途径。本研究从rhG-CSF抗凋亡角度,观察经过rhG-CSF干预之后,糖尿病合并脑梗死大鼠的神经功能改善情况、缺血周边区神经细胞凋亡数及Bcl-2、p53蛋白表达的变化,探讨rhG-CSF干预对糖尿病合并脑梗死的神经保护作用机制。实验材料和方法1、动物分组随机分为对照组、rhG-CSF组,各组又分为3个亚组,每亚组均为6只大鼠。rhG-CSF组的每个亚组分别于造模后3d、7d和14d连续皮下注射rhG-CSF(50μg/kg·d),对照组同时注射等量生理盐水。2、模型制备四氧嘧啶法制备大鼠糖尿病模型,大鼠连续2d腹腔注射四氧嘧啶120/100mg/kg,采用葡萄糖氧化酶法测末次给药后72h的空腹血糖值,以空腹血糖≥16.7mmol/L作为糖尿病大鼠;6周后用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉糖尿病大鼠。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。3、rhG-CSF干预rhG-CSF组于术后分别取3d、7d和14d颈部皮下注射rhG-CSF 50μg/kg,对照组于术后分别取3d、7d和14d颈部皮下注射等量的生理盐水。4、采用NSS评分标准进行神经功能缺损评分5、TUNEL法检测细胞凋亡情况6、免疫组织化学法检测Bcl-2及p53蛋白的表达结果1、rhG-CSF干预组神经功能缺损评分明显低于对照组(P＜0.05)2、rhG-CSF干预组缺血周边区的TUNEL阳性细胞数均明显少于对照组(P＜0.01);3、Bcl-2蛋白免疫阳性细胞明显多于对照组(P＜0.01),p53蛋白免疫阳性细胞明显少于手术对照组(P＜0.01)。讨论糖尿病容易合并脑梗死,由于其血管损伤严重,同时存在代谢障碍,使其合并脑梗死时神经功能缺损严重,治疗更为棘手。因此,探讨行之有效的治疗方法至关重要。凋亡参与了脑缺血后神经损伤的形成和发展,细胞凋亡的发生是由基因调控的过程,Bcl-2和p53被认为是抑制和促进细胞凋亡最重要的基因。提示如果某种药物可以影响Bcl-2和p53的表达对抗凋亡,则对缺血性脑血管病的治疗有重要意义。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种造血细胞生长因子,具有较强的动员骨髓干细胞的能力,可同时动员造血干细胞和间充质干细胞向缺血性脑梗死动物模型的梗死部位迁移,激活脑内成体神经干细胞,刺激其增殖和分化,还能促进脑内各种神经营养因子的分泌,减小脑缺血动物模型的缺血灶,促进慢性卒中模型缺失神经功能的长期恢复。其作用机制可能包括:抗凋亡,抗炎症,促进血管生成及促进神经祖细胞分化等多种途径。G-CSF作为一种新的神经营养因子,对脑卒中的治疗有着诱人的前景。有研究显示G-CSF可预防糖尿病的发生,还有较多研究表明可减轻脑缺血动物模型的神经损伤,但对糖尿病合并脑缺血是否同样有作用,目前尚未见报道。本研究从rhG-CSF抗凋亡角度,观察经过rhG-CSF干预之后,脑缺血3d、7d、14d rhG-CSF干预组的神经功能评分均明显低于对照组,说明应用rhG-CSF能够改善局灶性脑缺血糖尿病大鼠的神经功能。本研究结果还显示,应用rhG-CSF后缺血周边区TUNEL免疫阳性细胞明显少于对照组,提示应用rhG-CSF可抑制缺血周边区神经细胞的凋亡,减轻糖尿病合并的缺血性脑损伤。同时,本研究结果还显示rhG-CSF的应用能明显增加脑缺血周边区Bcl-2蛋白的表达,即脑缺血3d、7d、14d缺血周边区Bcl-2蛋白免疫阳性细胞数均明显高于对照组;减少p53蛋白的表达,即3d、7d、14d脑缺血周边区p53蛋白免疫阳性细胞数均明显低于对照组。以上结果表明,随着Bcl-2蛋白的增加和p53蛋白的减少,各时间点神经细胞的凋亡明显减少,两者相对应。这一点提示rhG-CSF抗凋亡作用可能通过增加Bcl-2蛋白和减少p53蛋白来实现的。因此rhG-CSF改善糖尿病脑缺血后的神经功能缺损可能与增加缺血灶周边区Bcl-2蛋白的表达,减少p53蛋白的表达,从而减少脑缺血周边区脑组织细胞凋亡有关。综上所述,rhG-CSF对糖尿病合并的脑梗死同样具有神经保护作用,而关于其对单纯脑梗死、单纯糖尿病、及对糖尿病和并的脑梗死的治疗作用哪种更显著将在下一步研究中探究。同时,本研究仅从细胞、蛋白水平来研究rhG-CSF的抗凋亡作用,具体的分子机制还有待于进一步探究。结论rhG-CSF可增加糖尿病合并脑梗死之后缺血周边区Bcl-2蛋白的表达,减少p53蛋白的表达,拮抗神经细胞凋亡,改善神经功能。这可能是rhG-CSF治疗糖尿病合并脑梗死的机制之一。