以DXS和DXR为靶点的新型抗弧菌药物高通量筛选模型的建立与应用

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弧菌病是水产动物最主要的细菌病之一,其爆发性强,死亡率高,每年给我国水产养殖业造成重大经济损失。目前细菌性病害的防治主要依靠抗生素及化学药物。然而,抗生素的大量盲目地使用,导致了耐药性菌株不断出现,使病害更加难以控制,因此需要不断地寻找新的、安全的抗菌药物。  类异戊二烯是弧菌合成细胞壁结构单元肽聚糖的骨架分子,也是参与能量代谢等多种生物过程的十分重要的生理活性物质。生物体内的类异戊二烯类化合物主要有两种生物合成途径:甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径,其中MEP途径广泛存在于大多数细菌、藻类、地衣及高等植物中,但目前该途径尚未在人体和动物体中发现,因此MEP途径的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)成为潜在的、具有较好选择毒性的抗弧菌药物的分子靶点。  本研究以创伤弧菌MEP途径中的关键酶DXS及DXR为研究对象,通过分子生物学方法,构建了创伤弧菌DXS和DXR蛋白的表达载体;优化了蛋白的表达条件,获得了可溶性表达的VvDXS和VvDXR蛋白;采用亲和层析法对表达产物VvDXS和VvDXR进行了纯化,获得了两个具有天然酶活性的可溶性蛋白;建立了VvDXS和VvDXR的酶活测定体系,并对反应温度、缓冲液pH、底物浓度、反应酶量等条件进行了优化;在上述基础上建立了VvDXR抑制剂的筛选体系,构建了靶向VvDXS和VvDXR的VvDXS-VvDXR抑制剂高通量筛选模型并评价了模型的可行性;应用VvDXS-VvDXR偶联模型对57个化合物进行了筛选,得到了个1个VvDXR抑制剂,经抗弧菌活性评价获得了1个具有抗弧菌活性的馏分,编号为170-1。
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