目的:以SD大鼠原代海马神经元为研究对象,寻求雄激素膜结合位点存在的直接证据,验证原代海马神经元雄激素膜结合位点的存在及与胞内受体的异同点同时进一步探究表达膜结合位点的神经元的类型。之后,明确雄激素非基因组途径对海马神经元突触蛋白PSD95的影响,并阐明CaM/CaMKⅡ信号通路的影响机制,以充分理解雄激素发挥生理作用的方式,为进一步推动雄激素的神经保护机制的研究提供突触可塑性方面的依据。方法:1海马神经元雄激素膜受体的研究(1)验证海马神经元雄激素膜结合位点(膜受体)的存在选用孕18 d的SD大鼠,麻醉后取出胎鼠,无菌取脑、剥离海马,消化、吹打、重悬过滤后,接种于共聚焦培养皿。培养至15~20 d,随机分为BSA-FITC组和T-BSA-FITC组。分别孵育BSA-FITC和T-BSA-FITC 15min。激光共聚焦显微镜观察T-BSA-FITC与海马神经元细胞膜的结合情况,验证海马神经元雄激素膜结合位点(膜受体)的存在。(2)海马神经元雄激素膜受体与胞内受体的差异性研究选用孕18 d的SD大鼠,麻醉后取出胎鼠,无菌取脑、剥离海马,消化、吹打、重悬过滤后,接种于共聚焦培养皿。培养至15~20 d,预先给予氟他胺15 min再给予T-BSA-FITC 15 min。激光共聚焦显微镜观察经典的雄激素胞内受体拮抗剂氟他胺能否抑制雄激素与膜受体的结合。另设竞争性实验,用过量游离T提前孵育神经元15 min,再加入T-BSA-FITC孵育15 min,观察T-BSA-FITC与海马神经元细胞膜的结合情况。(3)表达雄激素膜受体的海马神经元的类型(兴奋性/抑制性)研究选用孕18 d的SD大鼠,麻醉后取出胎鼠,无菌取脑、剥离海马,消化、吹打、重悬过滤后,接种于24孔板。培养至15~20 d,加入T-BSA-FITC孵育15 min,然后用4%多聚甲醛固定。利用免疫荧光细胞化学技术,以vGLUT1抗体标记谷氨酸能神经元(兴奋性)。以γ-氨基丁酸(GABA)抗体标记GABA能神经元(抑制性)。激光共聚焦显微镜观察T-BSA-FITC与抗体表达共定位情况,分析表达有雄激素膜受体的神经元中兴奋性和抑制性神经元亚群情况。2雄激素膜受体介导的CaM/CaMKⅡ信号通路对海马神经元突触蛋白PSD95的影响(1)雄激素对原代海马神经元突触蛋白PSD95的影响选用孕18 d的SD大鼠,麻醉后取出胎鼠,无菌取脑、剥离海马,消化、吹打、重悬过滤后,接种于6孔板。培养至15~20 d,随机分为对照组(Con组)、T组、T-BSA组,药物作用时间为1 h,提取细胞蛋白。应用免疫印迹方法,检测海马神经元突触蛋白PSD 95的表达情况。(2)雄激素对原代海马神经元CaM/CaMKⅡ信号通路的影响选用孕18 d的SD大鼠,麻醉后取出胎鼠,无菌取脑、剥离海马,消化、吹打、重悬过滤后,接种于6孔板。培养至15~20 d,随机分为Con组、T组、T-BSA组,药物作用时间为1 h,提取细胞蛋白。应用免疫印迹方法,检测海马神经元CaM、CaMKⅡ和P-CaMKⅡ的表达情况。(3)雄激素膜受体介导的CaM/CaMKⅡ信号通路对海马神经元突触蛋白PSD 95的影响选用孕18 d的SD大鼠,麻醉后取出胎鼠,无菌取脑、剥离海马,消化、吹打、重悬过滤后,接种于6孔板。培养至15~20 d,随机分为Con组、T组、T-BSA组、CaMKⅡ抑制剂KN93+T组(KN93+T组),药物作用时间为1 h,提取细胞蛋白。KN93+T组给予T之前,预先给予KN9330 min。应用免疫印迹方法,检测海马神经元突触蛋白PSD 95的表达情况。结果:1.验证海马神经元雄激素膜受体的存在海马神经元培养至15~20 d时,胞体丰满,形态多样,有锥形、三角形、梭形、椭圆形等。突起增粗延长,树突分支增多,交织呈网状。T-BSA-FITC与海马神经元特异性结合处显示为绿色荧光。T-BSA-FITC组海马神经元细胞膜以及突起的起始部和远端均有广泛的绿色荧光标记,而神经元内部的细胞质及细胞核均无绿色荧光标记,验证了海马神经元存在雄激素膜受体。BSA-FITC组海马神经元未观察到绿色荧光结合部位,排除了BSA与细胞膜相互作用对上述结果可能存在的影响。(见图1)2.海马神经元雄激素膜结合位点与胞内受体的差异性研究预先给予氟他胺,再给予T-BSA-FITC,海马神经元细胞膜以及突起的根部和远端均有绿色荧光,但标记部位有所减少,表明氟他胺未完全阻断T-BSA-FITC与细胞膜的结合。过量游离T预先孵育,,再给予T-BSA-FITC,几乎未检测到任何绿色荧光标记,表明T预先孵育可以完全阻断T-BSA-FITC与细胞膜的结合。(见图2)3.表达雄激素膜受体的海马神经元的类型(兴奋性/抑制性)研究vGLUT1抗体标记谷氨酸能神经元(兴奋性)和GABA抗体标记GABA能神经元(抑制性)的两组不同的神经元类型与T-BSA-FITC均存在共标情况。v GLUT1抗体标记谷氨酸能神经元的研究中,共观察了224个神经元。其中,140个神经元表达vGLUT1,谷氨酸能神经元所占比例为62.50%;122个神经元同时被T-BSA-FITC标记,双标记神经元占兴奋性神经元比例为87.14%(见图3)。GABA抗体标记GABA能神经元的研究中,共观察了207个神经元。其中,73个神经元表达GABA,GABA能神经元所占比例为35.27%(见图4);52个神经元同时被T-BSA-FITC标记,双标记神经元占抑制性神经元比例为71.23%。(见表1)4.雄激素对原代海马神经元突触蛋白PSD95的影响PSD95免疫印迹实验结果显示:与Con组(0.209±0.016)相比,T组(0.374±0.033)、T-BSA组(0.363±0.026)条带相对于内参GAPDH的光密度值明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);T组与T-BSA组之间无差别。(见图5与表2)5.雄激素对原代海马神经元CaM/CaMKⅡ信号通路的影响CaM的免疫印迹实验结果显示:与Con组(0.146±0.021)相比,T组(0.247±0.037)、T-BSA组(0.241±0.024)条带相对于内参GAPDH的光密度值明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);T组与T-BSA组之间无差别。CaMKⅡ及磷酸化免疫印迹实验结果显示:在p-CaMKⅡ的结果中,与Con组(0.061±0.011)相比,T组(0.145±0.013)、T-BSA组(0.138±0.011)条带相对于内参GAPDH的光密度值明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);T组与T-BSA组之间无差别。在CaMKⅡ的结果中,与Con组(0.252±0.015)相比,T组(0.244±0.016)、T-BSA组(0.257±0.016)条带相对于内参GAPDH的光密度值无明显差异,无统计学意义;T组与T-BSA组之间无差别。(见图6、图7与表3)6.雄激素膜受体介导的CaM/CaMKⅡ信号通路对海马神经元突触蛋白PSD 95的影响PSD95免疫印迹实验结果显示:与Con组(0.261±0.014)相比,T组(0.437±0.050)、T-BSA组(0.420±0.037)、K+T组(0.350±0.026)条带相对于内参GAPDH的光密度值明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);K+T组比T组、T-BSA组减低,差异有统计学意义(P<0.05);T组与T-BSA组之间无差别。(见图8与表4)结论:1.SD大鼠海马神经元存在雄激素膜结合位点,雄激素膜结合位点与胞内受体存在特征性差异,且雄激素膜结合位点可以被游离T竞争性结合。表达雄激素膜结合位点的神经元多数为谷氨酸能神经元(兴奋性),少数为GABA能神经元(抑制性)。2.雄激素在短时间内快速增加了海马神经元突触蛋白PSD95的表达,激活了海马神经元CaM/CaMKⅡ信号通路。CaM/CaMKⅡ信号通路参与膜受体介导的雄激素对海马神经元突触蛋白PSD95的影响。