论文部分内容阅读
水稻白叶枯病是由黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo）侵染引起的,是世界水稻生产上重要的细菌病害之一。病原菌主要通过水孔或伤口侵入水稻木质部,III型分泌系统及其效应子、胞外多糖（EPS）、胞外酶等毒性因子在Xoo致病性中起关键作用。c-di-GMP是细菌中广泛存在的第二信使,可以调控生物膜形成、运动性、毒性、细胞周期等生物学表型,含有GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶（DGC）和含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶（PDE）分别控制c-di-GMP的合成与降解。本实验室前期研究表明,Pde R是一个含有GGDEF-EAL-REC多结构域的应答调节蛋白,具有PDE酶活性降解c-di-GMP,与组氨酸激酶Pde K组成一对双组份系统,参与调控EPS产生和Xoo毒性。为了进一步探索Pde R对Xoo毒性调控的分子机理,本研究从寻找Pde R的互作蛋白入手,并对互作蛋白的功能进行解析,旨在阐明Pde R的作用机制,为全面揭示c-di-GMP信号途径和细菌致病机理提供更多的科学依据。取得的主要进展如下:1.Pde R互作蛋白的筛选和鉴定本研究构建了PXO99A菌株的c DNA文库,采用酵母双杂交（Y2H）方法,以Pde R蛋白为诱饵蛋白,进行了c DNA文库筛选,以获得Pde R的互作蛋白。Y2H和GST pull-down验证了2个互作蛋白PXO04421（命名为Tri P）和PXO00987。发现随着互作反应体系中c-di-GMP浓度增加,Tri P与Pde R结合作用受到抑制。Tri P为Omp R/Pho B家族转录调控因子之一,其N端含有信号接收结构域（REC）、C端含有DNA结合结构域（HTH）,推测可能具有调控下游基因转录的功能。PXO00987为乙酰转移酶之一,其编码基因位于Xoo鞭毛基因簇的糖基化岛中,推测其可能参与调控鞭毛运动性。2.转录调控因子Tri P功能研究本研究首先通过同源置换法构建了tri P缺失突变体（Δtri P）,进一步测定了其表型及毒性变化。结果发现与野生型PXO99A相比,tri P突变后EPS产量降低、Xoo毒性减弱,但鞭毛运动性未受影响,与pde R突变体表型一致,表明两者可能位于同一信号通路中。进一步通过RNA-seq技术分析Δtri P及Δpde R突变体中差异基因表达情况,发现Δtri P突变体倾向于激发一些基因的高表达,而Δpde R突变体除了能够激发一些基因高表达外,更倾向于抑制一些基因的表达,两者既有共同的调控通路,也有各自不同的调控通路。3.乙酰转移酶PXO00987功能研究本研究通过同源置换法构建了PXO00987基因缺失突变体（ΔPXO00987）,进一步测定了突变体的表型及毒性变化。发现与PXO99A相比,ΔPXO00987的EPS产量降低、鞭毛运动性增加、生物膜形成减少及Xoo致病性减弱,我们推测Xoo致病性减弱可能与毒性因子减少有关。此外,PXO00987位于预测的糖基化岛中,可能参与鞭毛蛋白翻译后修饰作用,因此从野生型及ΔPXO00987突变体中提取鞭毛蛋白进行糖基化检测,发现ΔPXO00987中鞭毛素（Fli C）蛋白糖基化作用缺失,表明PXO00987可能参与了Fli C糖基化修饰。4.Pde R亚细胞定位研究本研究通过构建Pde R-GFP融合表达载体,观察其亚细胞定位,发现Pde R主要定位在细胞两极。进一步研究结构域对其定位的影响,发现GGDEF及REC结构域缺失后影响Pde R的极端定位;同时研究了互作蛋白Pde K、Tri P对Pde R定位的影响,发现Tri P影响Pde R的极端定位,因此,Pde R亚细胞定位受到互作蛋白Tri P的影响,且REC、GGDEF结构域是影响Pde R亚细胞定位的关键结构域。总之,本研究通过对Pde R互作蛋白功能的研究,表明反应调控因子Tri P参与了Pde R介导的c-di-GMP信号途径,而乙酰转移酶PXO00987具有自己的调控功能,参与鞭毛蛋白糖基化修饰过程,是否参与Pde R介导调控途径尚不清楚。通过对Pde R亚细胞定位研究,发现Pde R主要定位在两极,可能与毒性调控有关。因此,本研究进一步揭示了Pde R在细胞中的调控机制,为全面了解Xoo中c-di-GMP信号传导机制提供更多的实验依据。