M通道电流是由Brown及Adams于1980年首次在牛蛙颈上交感神经节中发现,它是广泛分布于神经系统中的一种电压依赖性钾电流,具有慢激活、慢去活、非失活的特征。同时M电流也是唯一在神经元阈电位附近激活的电流。目前研究证明Kv7通道家族的成员(Kv7.2,Kv7.3,Kv7.5)构成的单聚体或异二聚体构成M通道的编码蛋白。M通道功能降低可以导致神经元兴奋性的增高,从而诱发癫痫等疾病。众多神经递质和肽类可以调节M电流进而影响神经元的兴奋性。近年来,关于神经递质等调控M电流的分子机制的研究有很多,其中以乙酰胆碱激动M型胆碱受体(M1)和缓激肽激动其II型缓激肽受体(B2受体)后调节M电流的分子机制最具代表性。虽然两种受体激活均可以抑制M电流,但是其分子机制却不相同。其中细胞内钙的变化是这两者不同的关键所在。然而,对于造成这一不同的机制还不很清楚。本论文的第一部分将对上述两种膜受体调节表达于大鼠颈上交感神经节(SCG)神经元中的Kv7/M通道的机制展开研究,重点探讨细胞膜脂筏在调节机制中的作用。容积调节氯通道(volume-activated chloride channel,VACC)最初发现于胚鼠主动脉血管平滑肌细胞,随着研究的深入,发现几乎所有脊椎动物的细胞体积膨胀都可以激活VACC。VACC在维持细胞容积和离子平衡发面发挥重要作用,并由此在细胞的增殖与分化、细胞凋亡、血管肌源性反应、激素分泌及各种生物体的跨膜氯离子转运等过程发挥重要作用;此外在抗癌药物耐药、兴奋性神经中毒、缺血损伤或炎症反应过程中也发挥重要作用。关于VACC的分子基础仍未定论。诸如P-糖蛋白、核酸敏感性氯通道蛋白、电压依赖性氯通道中的ClC2和ClC3、以及钙激活氯通道(bestrophin及TMEM16A)等都曾被认为可能参与构成VACC的分子基础。至于vacc的激活机制则同样争论颇多。vacc激活的必要条件是细胞体积的肿胀,但由此怎样触发了vacc的激活则不确定。细胞内ca2+、atp释放、众多蛋白激酶、细胞内离子强度、脂筏等都有报道参与了vacc的激活。本论文的第二部分将研究大鼠背根神经节(drg)神经元中的vacc,重点研究vacc的药理学特征及分子基础,后者以bestrophin及tmem16a在构成vacc中的作用为重点;第三部分将研究大鼠背根神经节(drg)神经元中的vacc的激活机制,重点研究细胞内ca2+及磷脂酶c在vacc激活中的作用。论文具体内容如下:第一部分大鼠scg神经元中kv7/m电流的受体特异性调控的机制研究目的:研究大鼠scg神经元细胞膜微域在受体特异性调节kv7/m电流中的作用。方法:(1)利用电生理穿孔膜片钳技术记录kv7/m电流,并对比不同条件下,m1与b2受体激动后对kv7/m电流的抑制情况;(2)利用蔗糖密度梯度离心的方法分离细胞膜脂筏,观察受体及相关信号蛋白的分布;(3)利用激光共聚焦钙成像技术,观察不同条件下b2受体激动后细胞内钙变化;(4)利用免疫共沉淀的方法观察ip3受体与b2受体的相互作用。结果:(1)在大鼠scg神经元中,oxo-m(m胆碱受体激动剂)与bk(缓激肽,b2受体激动剂)抑制kv7/m电流的ec50分别是0.44±0.09μm和1.73±0.77nm。5μmoxo-m与100nmbk即可以达到最大抑制,抑制率分别为82±6.3%和77±7.1%。甲基-β-环糊精(mβcd)可以抽提细胞膜胆固醇,从而破坏脂筏。当使用5mmmβcd处理scg神经元时,oxo-m诱导的kv7/m电流的抑制与对照组没有差别。而bk诱导的kv7/m电流的抑制大幅下降。当使用10mmmβcd处理scg神经元时,oxo-m与bk诱导的kv7/m的抑制均减小。而mβcd的无效结构类似物αcd对oxo-m与bk的作用没有影响。(2)蔗糖密度梯度离心后,脂筏的标记蛋白caveolin-1分布在低浮力密度区(3-5层)。同时在脂筏区域可以检测到b2r,gq,g11,plcβ1以及plcβ4的分布,但是检测不到m1r的分布。使用5mmmβcd处理scg组织之后,脂筏被破坏,caveolin-1移向高密度区(6-9层),同时b2r也移动到脂筏外区域。反之,使用b2r激动剂处理scg组织后,一部分b2r会“移入”脂筏中。而oxo-m的处理对于m1r的分布没有影响。(3)scg神经元中,在细胞内外钙都存在的情况下,b2r激动后引发的细胞内钙的升高可以被mβcd的孵育所阻断;当使用无钙的细胞外液时,b2r激动后引发的细胞内钙的升高同样可以被mβcd的孵育所阻断;但是当外钙存在而细胞内钙库被thapsigargin耗竭之后,mβcd处理之后b2r激动所引发的胞内钙浓度的升高反而增加。(4)免疫共沉淀实验表明,大鼠scg中ip3r与b2r之间存在相互作用,当用mβcd处理之后,这种相互作用会消失。结论:(1)脂筏在缓激肽Ⅱ型受体(b2r)调节scg神经元kv7/m通道功能中发挥重要作用;(2)大鼠颈上神经节中存在脂筏微域,且b2r及其相关细胞信号转导分子如gq、g11、plcβ4和plcβ1都在脂筏中有分布;m1受体可能不存在脂筏中;(3)在细胞内、外钙都存在的情况下,b2r激活后升高细胞内钙依赖于细胞膜脂筏的完整性;在无细胞外钙时,b2r激活后诱发的胞内钙库的钙释放也依赖于细胞膜脂筏的完整性;然而当细胞内钙库耗竭之后,脂筏的破坏却可以进一步增加b2r激动后引发的外钙内流;(4)ip3r与b2r之间的相互作用依赖于脂筏微域的完整性。第二部分大鼠drg神经元中容积激活氯通道电流的鉴定及其分子基础的研究目的:记录大鼠drg神经元中容积激活的氯电流(volumeactivatedchloridecurrents,vacc)并探讨其分子基础。方法:(1)使用420mosm的cscl内液与320mosm的nacl外液,利用全细胞膜片钳技术记录大鼠drg神经元以及稳定转染tmem16a的cho细胞中vacc;(2)构建装载有针对tmem16a或bestrophin-1的sirna慢病毒,感染drg神经元后,利用q-pcr的方法检查病毒敲低效率,并记录vacc的变化。结果:(1)当电极内液为420mosmcscl,外液为320mosmnacl时,随着细胞容积的增大,在-60mv钳制电压下可以记录到vacc。在大、中、小直径的drg神经元中都可以记录到vacc,平均电流密度约为11pa/pf。当膜电位钳制在-60mv,然后给予-100mv到+100mv的ramp电压钳制程序时,vacc呈现明显的外向整流特性。另外,当使用步阶去极化电压时,vacc呈现快速激活且快速去活的特征,当膜电位高于60mv时出现失活现象。当将电极内液的cscl换成cs2so4且维持原高渗状态时时,vacc几乎消失;含有cscl但与与外液等渗(320mosm)的电极内液同样不能诱发vacc。另外,vacc可以被氯通道阻断药nppb所阻断。被nppb所阻断的电流的反转电位约为0mv,这与nernst方程所计算的氯平衡电位(-2mv)接近。(2)vacc对常用的氯通道阻断剂比较敏感,包括尼氟灭酸(niflumicacid,nfa)、5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(5-nitro-(3-phenylpropylamino)-benzoicacid,nppb)、鞣酸(tannicacid)、4,4’-二异硫氰酰-2,2’-二磺酸(4,4’-diisothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonicacid,dids)及cacc-a01都可以抑制vacc。在同为100μm浓度下,nfa、nppb、tannicacid、dids、cacc-a01分别抑制了vacc51.7±7.4%,79.9±4.7%,75.5±2.8%,18.1±4.5%、87.4±4.7%,其中以cacc-a01最强,dids最弱。(3)电极内液中加入20mmbapta时,vacc几乎完全被抑制,然而20mmegta无作用;同样,使用thapsigargin耗竭细胞内钙库之后,vacc也很大程度被抑制。(4)利用sirna降低tmem16a后,vacc的电流密度明显降低:以scrambledtmem16asirna组为对照,其vacc为10.86±2.17pa/pf,tmem16asirna组的vacc则降为4.98±1.09pa/pf。而bestrophin-1的sirna则对vacc的电流密度没有影响。(5)经由电压依赖性钙通道(vdcc)内流的ca2+可以激活bestrophin-1电流。此电流不同于vacc电流。(6)当将tmem16a表达在cho细胞后,在使用与drg神经元相同的记录条件下,高渗内液也可在表达有tmem16a的cho细胞诱发vacc,且与drg神经元vacc有类似特征,可被细胞内bapta阻断,而egta则无效。结论:(1)大鼠drg神经元中,通过使用420mosmcscl电极内液及320mosmnacl电极外液,在全细胞膜片钳记录模式下可以记录到容积激活的氯电流。其对一些常用的氯通道阻断剂都比较敏感,但对dids较不敏感。(2)drg神经元中容积调节氯通道的激活依赖于细胞内局部钙的升高。(3)tmem16a可能参与大鼠drg神经元中容积激活氯通道的分子构成,而bestrophin-1可能与其无关。第三部分大鼠drg神经元中容积调节氯通道的调控机制研究目的:研究大鼠drg神经元中vacc的激活机制。方法:(1)利用全细胞膜片钳技术记录大鼠drg神经元中的vacc;(2)利用激光共聚焦钙成像技术观察细胞内钙浓度的变化;(3)构建装载有plcβ3sirna的慢病毒,感染drg神经元后,利用q-pcr的方法检查病毒敲低效率,并记录vacc的变化;(4)利用全细胞膜片钳技术记录hek293a细胞中内源性的vacc。结果:(1)外液中加入2mmegta螯合钙离子,得到低钙外液,此低钙外液对vacc没有影响;在等渗细胞内外环境下,高浓度细胞内游离钙(7.4μm)不能激活vacc。(2)20u/mlatp水解酶apyrase对vacc电流密度无影响;电极内液去掉atp对vacc的电流密度也无影响;drg神经元直接给予100μmatp不能激活vacc;嘌呤能受体阻断剂suramin(100μm)对vacc呈电压依赖性抑制,在-60mv和+100mv的抑制率分别为27.65±4.36%和77.38±8.83%,作用起效快,冲洗后快速恢复。(3)在转染tmem16a的cho细胞中,suramin对tmem16a介导的vacc的作用与对drg神经元中vacc的作用类似;在等渗条件下,tmem16a被细胞内高浓度游离钙(447nm)激活后,suramin也可以以类似于阻断vacc的特征阻断tmem16a电流。(4)电极内液中加入500μmgdp-βs时,对vacc的激活无影响。(5)5mmmβcd增大drg神经元中vacc的电流密度。(6)使用plc阻断剂依地福新(edelfosine)或u73122处理细胞之后,vacc的电流密度会大幅下降;而u73122的无效结构类似物u73343对vacc无影响。(7)低渗(220mosm)细胞外液同样可以诱发vacc,而且仍可以被细胞内bapta所阻断;低渗外液诱发的细胞内钙的升高也可以被u73122所阻断。(8)利用sirna降低plcβ3之后,drg神经元中vacc的电流密度有显著性下降。(9)hek293a细胞中可以记录到明显的vacc,且可以被细胞内高浓度BAPTA阻断;使用不含ATP的电极内液对此VACC无影响;在等渗条件下,细胞外给予100μM ATP记录不到VACC样电流;与DRG神经元VACC类似,suramin对HEK293A中内源性VACC可产生快速的电压依赖性抑制。结论:(1)大鼠DRG神经元中VACC的激活由相邻于通道的局部钙的升高所致,而与细胞外钙无关;(2)大鼠DRG神经元中VACC的激活不需要ATP及G蛋白的参与;suramin对VACC有直接抑制作用;(3)破坏脂筏可以显著性增大大鼠DRG神经元中VACC;(4)大鼠DRG神经元中VACC的激活以及低渗外液诱发的细胞内钙的升高依赖于PLC的激活,且PLCβ3亚型可能参与其中;(5)HEK293A细胞有比较大的内源性VACC,其特征与激活机制与DRG神经元VACC相似。