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研究目的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以关节滑膜炎为的慢性自身免疫性疾病。其特征是对称性、侵袭性的多关节炎症,可以导致关节畸形及功能丧失。RA的治疗策略主要是减轻关节炎症,防止不可逆的骨质破坏,达到病情完全缓解或降低疾病活动度。他克莫司(tacrolimus,TAC、FK506)是一种钙调神经磷酸酶抑制剂,可以特异性降低神经钙调磷酸酶(CN)活性以抑制T细胞增殖,并通过抑制白细胞介素2(Interleukin2,IL-2)的释放,全面抑制T淋巴细胞活化和分泌细胞因子。目前已有多篇报道证实了 TAC治疗RA的有效性和安全性,可以短时间内有效控制病情,尤其是重度RA患者,从而减少关节毁损,改善患者生活质量。半乳凝集糖-9(Galectin-9,Gal-9)是内皮细胞分泌的哺乳动物凝集素,可以趋化嗜酸性粒细胞、癌细胞和免疫细胞,发挥着调节免疫、增殖等多种作用。Gal-9 是 T 细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin domain and mucin-3,Tim-3)的配体,二者结合后可以下调IFN-Y的表达,诱导CD4+T细胞凋亡,有研究发现,RA患者滑膜组织和滑膜液中存在Gal高表达[1],Gal-9可以通过阻止肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-1的产生或通过免疫复合物激活巨噬细胞产生IL-10抑制关节炎的发生[2],因此认为Gal-9在RA发病中是负性调节因子。但这一观点不断受到对Gal-9功能新研究结果的质疑,近年发现Gal-9的C端和N端CRD与Tim-3的结合方式和亲和力不同,Gal-9-N端可以激活浆样树突细胞(DC)[3]、增强NK细胞毒作用并诱导TNF-α产生而启动天然免疫。血管内皮细胞(EC)表达Gal-9,但文献报道Gal-9不同的剪接变异体对EC细胞生物学的作用不一,可能受Gal-9胞内定位、浓度和细胞环境影响[4]。这表明Gal-9可以通过不同浓度不同途径方式促进先天免疫、调节适应性免疫和细胞增殖。目前在临床上,对Gal-9在RA患者外周血中的表达和变化规律研究报道不多。本研究旨在观察使用TAC特异性改变中重度RA患者T细胞功能前后患者的病情活动度、外周血T细胞亚群和Gal-9表达的变化规律及相关关系,进一步明确Gal-9与RA病情活动度的相关性,验证Gal-9作为RA病情变化的生物学标记作用,及Gal-9参与RA免疫炎症和血管生成的机制。研究方法收集山东大学齐鲁医院风湿科门诊和病房中重度RA患者治疗前77例,治疗后58例,其中治疗前后自身对照33例。根据根据入组原因分为反应不佳组(NR组)和不耐受组(NT组),有关节外表现组(WG组)和无关节外表现组(NG组),根据治疗方案是否联合MTX和激素,分为联合MTX组(WM组)和不联合MTX组(NM组),联合激素组(WP组)和不联合激素组(NP组),所有入组患者均随访至12周(w),分别收集RA患者性别、年龄,基线(Ow)及12w外周血WBC计数、淋巴细胞比率、血沉(ESR)和C反应蛋白(CRP)数值,关节疼痛数(T28)和肿胀数(SW28),记录患者健康评价调查表(HAQ),病人总体评分(PGA)及医生对患者的病情评估(PHGA),分别计算患者疾病活动度指标,即DAS28-ESR、DAS28-CRP、SDAI、CDAI。同时收集我院体检中心健康体检者同年龄性别匹配的健康体检者58例,作为健康对照组(HD组)。流式细胞术方法检测外周T细胞亚群即CD4+、CD8+、CD4+CD8+(Double positive T cell,DPT)、CD4-CD8-(Double negative T cell,DNT)以及CD3+CD4+CD25+CD127low标记的调节性 T 细胞(Regulatory T cells,Treg),单核细胞(CD14+),分别测定各亚群的百分数及亚群上Gal-9的表达水平。采用酶联免疫吸附测定技术(ELISA)检测血浆中Gal-9、VEGF、IL-2、IL-6、TNG-α的表达水平,并使用SPSS 22.0软件进行相关统计分析。结果1.所有入组患者规律使用TAC 12 w后的炎症指标、疾病活动度指标与基线相比均显著下降(P<0.01),;2.流式分析发现33例RA患者外周血Treg细胞占CD4+的百分比基线值较HD组升高,治疗12w后下降(P<0.01);3.ELISA结果显示33例RA患者血浆中Gal-9、IL-6、TNF-α、VEGF等细胞因子的基线值水平均较HD组均有明显升高(P<0.01),而治疗后RA患者血浆Gal-9的水平降低(P<0.05)。4.对TAC治疗前77例、治疗后58例RA患者进行各自时点的相关性分析,并对33例自身对照RA患者进行治疗前后各指标的分析发现,77例治疗前、58例治疗后和33例治疗后RA患者血浆中的Gal-9和CDAI、DAS28-CRP均具有正相关关系;Treg占CD4+T细胞亚群的比例和多个T亚群上Gal-9的表达有正相关关系,77例治疗前、58例治疗后和33例治疗前后外周血Treg与DPT+Gal均具有正相关关系;对治疗后58例RA患者相关分析发现,血浆中Gal-9和各个T亚群上Gal-9均具有正相关关系。结论1.他克莫司治疗RA是有效的,所有RA患者规律治疗后临床症状、炎症指标及疾病活动度指标均有明显下降。2.33例RA患者治疗前Treg占CD4+T细胞亚群的比例较HD组上升,表明RA病情活动度时Treg免疫调控也增加;治疗后Treg比例下降则提示TAC免疫抑制、病情活动度下降后Treg的负调节作用也减弱平息。3.RA患者血浆中Gal-9在治疗前较HD组明显升高,治疗后显著下降,且下降水平与疾病活动度正相关,提示Gal-9的反映疾病活动度的敏感指标,可以作为RA新的生物标记物。4.RA治疗前后时点,分别进行相关分析中均发现,Treg和多个T亚群Gal+具有正相关关系,且二者在治疗前后同向下降,提示Gal-9与T细胞亚群数目及功能密切相关,尤其是Treg的比率和功能,是其参与RA免疫调控的一个重要途径。