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记忆缺失性贝类毒素(Amnesic shellfish toxin,简称ASP)是由一种海洋硅藻—拟菱形藻Pseudo-nitzschia sp.产生的强神经性生物毒素,化学名称为软骨藻酸(domoic acid)。自1987年加拿大首次发生集体贝类食品中毒事件后,人们从赤潮藻类硅藻属(Diatom)的多列尖刺菱形藻中检测到软骨藻酸。鱼、贝通过滤食毒藻,将软骨藻酸富积在体内。人类因食用被软骨藻酸污染的鱼、贝而中毒。为了防止ASP中毒事件发生和保障食品安全,加拿大首先制定了软骨藻酸在贝类产品中最大安全限量为20μg/g贝肉,随后,美国、欧洲、以及澳大利亚等国家和地区也纷纷采用这一标准。根据欧盟委员会指令(2002/226/EC),当贝肉样品中软骨藻酸的含量超过这一限量时就禁止收获和上市。液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)是继液相色谱-质谱(LC-MS)和气相色谱-质谱(GC-MS)联用之后又一新兴的分离分析技术。与已成熟的GC-MS相比具有潜在的发展潜力,GC-MS只能分析易挥发、不分解且分子量小的有机物,而LC-MS/MS除了可以弥补GC-MS的不足以外,还具备分离能力强、样品用量少、分析时间短、选择性高、灵敏度高等优点,已广泛应用于蛋白质与肽组学研究、药物代谢机理、动力学研究、生物化学、有机化学、环境分析、卫生免疫以及食品检验等领域。本论文分为两个部分,第一部分建立了液相色谱-串联质谱测定贝类中软骨藻酸残留的检测方法,为准确快速测定贝类中软骨藻酸残留提供可靠的分析技术。第二部分是软骨藻酸在小鼠体内蓄积性的研究,主要是软骨藻酸在小鼠体内各个组织中的分布及代谢情况的研究。本论文目的之一是建立液相色谱-串联质谱测定贝类中软骨藻酸残留的检测方法。据大多数文献介绍,软骨藻酸多采用高效液相色谱-紫外法,其检测限(LOQ)为1μg/g;还有高效液相色谱-飞行时间质谱法的检测限(LOQ)为0.1μg/g;而本论文利用液相色谱-串联质谱建立一种测定贝类中软骨藻酸残留的检测方法,其目的是建立灵敏度更高、准确度更强、同时具有确认功能的一种分析技术,以满足目前国际上对有毒物质检测的要求。方法测定过程如下:优化样品前处理方法,样品经50%甲醇提取,LC-SAX柱净化, 3mL 0.1mol/L甲酸溶液洗脱;在色谱条件选择中:进样量:25μL;柱温:30℃;流动相:A:甲醇,B:0.02%甲酸+2mmol/L甲酸铵水溶液;流速为0.35mL/min。优化质谱条件:电喷雾离子源(ESI),在正离子、多反应监测方式(MRM)模式下进行定性与定量,定性离子对为m/z 311.98/265.91,m/z 311.98/247.9,m/z 311.98/192.91,以m/z 311.98/265.91为定量离子对,外标法定量。实验结果表明,该方法的检出限为0.01μg/g,定量限为0.02μg/g。在0.02～10μg/mL范围内线性相关系数为0.9999。当软骨藻酸添加浓度为20～1000ng/g时,虾夷扇贝样品中软骨藻酸的平均回收率为81.3%～105.4%,相对标准偏差(RSD)为3.90%～8.90%(n=6);巴菲蛤样品中软骨藻酸的平均回收率为91.8%～95.2%,相对标准偏差(RSD)为5.70%～9.20%(n=6);螠蛏样品中软骨藻酸的平均回收率为78.0%～90.8%,相对标准偏差(RSD)为2.00%～4.20%(n=6);长牡蛎样品中软骨藻酸的平均回收率为83.5%～106.6%,相对标准偏差(RSD)为4.60%～6.40%(n=6)。该方法可靠、灵敏度高,可满足对贝类产品中软骨藻酸残留的测定。本论文目的之二是研究软骨藻酸在小鼠体内各个组织中分布和体外代谢的规律。首先,验证了液相色谱-串联质谱测定贝类中软骨藻酸残留的检测方法是否适用于以小鼠体内各个组织为基质的软骨藻酸残留的检测。实验结果表明,当软骨藻酸添加浓度为20～500ng/g时,肝脏样品中软骨藻酸的平均回收率为83.4%～86.3%,相对标准偏差(RSD)为5.70%～7.20%;胃样品中软骨藻酸的平均回收率为79.4%～85.4%,相对标准偏差(RSD)为5.60%～7.40%;肌肉样品中软骨藻酸的平均回收率为81.0%～85.9%,相对标准偏差(RSD)为3.90%～7.70%;肾脏样品中软骨藻酸的平均回收率为78.3%～79.4%,相对标准偏差(RSD)为4.70%～6.30%;在0.02～10μg/mL范围软骨藻酸的峰面积响应值同软骨藻酸的量呈线性关系,相关系数为0.9999,方法的定量限为0.02μg/g。故而该方法适用于小鼠体内各组织中软骨藻酸的检测。采用腹腔注射法给小鼠注射一定量的软骨藻酸溶液,研究注射后小鼠的行为特征以及软骨藻酸在小鼠体内各个组织中的分布特征及代谢规律,采用液相色谱-串联质谱法测定小鼠体内各组织中软骨藻酸的浓度。按照0.45μg/g体重的注射剂量,采用腹腔注射法对昆明系雄性小鼠进行注射,毒素注射后分别于不同的时间(1h, 4h, 7h, 10h,24h, 48h,72h,120h)对小鼠的各组织进行取样,测定软骨藻酸在小鼠体内的分布情况。实验结果表明:小鼠注射软骨藻酸后,在1-120h时间内软骨藻酸在肝,肾,胃中分布量较大,软骨藻酸在小鼠体内各个组织中的分布量分别为:肝>胃>肾。而在其他五个组织心,脾,肺,血液和肌肉中只是在短时间内有微量软骨藻酸含量,在毒素注射10小时后这五个组织中软骨藻酸含量低于方法检出限。同时,本文也研究了软骨藻酸在小鼠体内蓄积率和体外代谢率。通过分析小鼠粪便和尿液,从毒素注射后1-120h,软骨藻酸在小鼠体外代谢率基本上随着时间延长而逐渐增加,在毒素注射72h后,软骨藻酸在小鼠体外代谢率最大并达到81.8%;而软骨藻酸在小鼠体内蓄积率随着时间延长而逐渐降低,在毒素注射120h后,软骨藻酸在小鼠体内蓄积率降至5.6%。由此可得,软骨藻酸在小鼠体内蓄积率较小,代谢率较大。实验证明了软骨藻酸在小鼠体内短时间内有一定蓄积量,但是毒素注射一周后,80%的软骨藻酸毒素都排出了体外。同时也说明软骨藻酸毒素代谢速度比较快,因而可以推测出人们若不慎食用了软骨藻酸污染的海产品(软骨藻酸含量低于食品安全标准),不会在体内蓄积,可以很快排出体外,不会产生慢性中毒。