白星花金龟幼虫蛋白的提取、分离纯化及抗炎性研究

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:pinghua_xu
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截至目前,国内外对白星花金龟的报道主要集中在防治技术和饲养管理这几个方面,对其蛋白质等资源利用的研究比较少见。课题主要对白星花金龟幼虫蛋白提取分离纯化,探究白星花金龟幼虫蛋白的抗炎活性成分,并对其抗炎效果和作用机制进行研究。通过本研究能够为白星花金龟这一新昆虫资源的充分开发和利用提供新的发展方向,且为白星花金龟等昆虫蛋白方面的研究提供新的思路和科学依据。本课题以白星花金龟3龄幼虫全虫为原料,主要研究结果如下:(1)白星花金龟幼虫蛋白的提取方法筛选及提取条件优化。采用盐溶法、碱溶法、酸溶法和醇溶法等4种方法提取白星花金龟幼虫蛋白,凯氏定氮法检测粗蛋白含量。以蛋白提取率、抗炎活性、细胞存活率为衡量指标,考察不同的提取方法和不同的提取时间、提取温度、提取pH、固液比、提取NaOH浓度等提取条件对所得蛋白抗炎活性的影响,确定最佳的白星花金龟幼虫蛋白提取方法及条件。结果显示,在55℃条件下,提取体系NaOH浓度为1.5%,固液比=1:15(W:V),提取时间1.5小时,沉淀pH为4的碱溶法提取的蛋白的蛋白提取率高且抗炎活性效果最佳。(2)建立LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞为炎症模型,评估提取蛋白的抗炎效果。通过Griess法测定细胞培养液NO含量,ELISA法检测细胞炎症因子IL-1β、TNF-α的含量。考察白星花金龟幼虫蛋白及各馏分的抗炎活性情况,确定白星花金龟幼虫蛋白中有效的抗炎活性成分。结果显示,白星花金龟幼虫抗炎蛋白能显著抑制炎症因子的释放,且在一定范围内以浓度依赖性的方式降低NO和促炎细胞因子IL-1β、TNF-α的含量。(3)抗炎蛋白SDS-PAGE凝胶电泳后,根据所得条带选用50KD和10KD的超滤管,将提取蛋白按大小差异分离成三个组分PB1、PB2、PB3,分别检测抗炎活性,发现PB3的抗炎活性最佳。高效液相色谱法进一步分离纯化组分PB3,色谱柱Sephadex G-15凝胶过滤层析,得到六个不同的馏分PB3-1、PB3-2、PB3-3、PB3-4、PB3-5、PB3-6,分别检测抗炎活性。结果显示馏分PB3-4的抗炎作用最佳。(4)实时荧光定量PCR法检测RAW264.7巨噬细胞mRNA的表达量,探究蛋白的抗炎相关作用机制和信号通路。结果显示,抗炎蛋白预处理RAW264.7巨噬细胞能显著下调其炎症介质一氧化氮合酶iNOS和促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA的表达。抗炎蛋白对RAW264.7巨噬细胞分子信号JNK、P38、TRAF6、ERK2、IκBα、NF-κB P65、ERK1和IKKβ的表达含量有影响作用。表明抗炎蛋白的抗炎效果是通过抑制相关的炎症调节因子和促炎因子的表达来发挥作用的,并能够在基因水平上影响其分子信号的表达。
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