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第一部分 人白细胞介素-10基因的克隆及转座元系统的构建 研究背景：细胞介素-10最主要的特征是能够影响T淋巴细胞的生长与分化。由于其能够抑制小鼠IL-2、IFN-γ和TNF-α，故最初被称为细胞因子合成因子，在人类，白细胞介素-10可由多种类型的细胞产生，包括T淋巴细胞(尤其是Th2细胞)、B淋巴细胞、吞噬细胞和NK细胞。HIL-10可抑制IL-2、IFN-γ、(GM-CSF)粒-巨噬细胞集落刺激因子和Th1细胞的增殖，抑制抗原递呈分子和共刺激分子的表达影响DC细胞的抗原递呈作用，阻碍成熟的单核细胞向DC细胞转化。正是IL-10具有较强的抗炎作用和免疫抑制作用，IL-10归属于为Th2类细胞因子。这就决定了IL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病的基因治疗等方面有重要、广阔的临床应用前景。Sleeping Beauty转座元(SB)是近年发现的哺乳动物转座元，可在Sleeping Beauty转座酶作用下将所携带的外源基因整合到脊椎动物细胞染色体上，介导外源基因长期表达。目的：人白介素10基因的克隆和转座元系统的构建。方法：应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术，从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10cDNA，将测序正确的hIL-10cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体。 南京医科大学博士学位论文结果:构建的含目的基因的载体能抑制淋巴细胞转化，即获得具有生物学活性的lL一10蛋白的表达。结论:所构建的含目的基因的载体和转座元系统为下一步研究lL一10在移植免疫中的作用，提供了条件。关健词:人类白细胞介素一10克隆第二部分转座元介导转人白细胞介素一10基因杭大鼠肝移植排斥反 应的实验研究研究背景:目前临床应用的免疫抑制剂虽能使移植排斥反应得到有效控制，但由于其对受者免疫系统非选择性的广泛抑制，常引起感染、，讼血管疾病、代谢性疾病、肿瘤等诸多并发症。即使临床肝移植应用兔疫剂，仍有约40%一70%的病人会发生排斥反应，在此过程中细胞因子发挥重要的作用。Thl细胞因子如IL一2、TNF一a、和IFN一丫调节细胞免疫反应，而ThZ细胞因子如IL一4和IL一10则能够抑制Thl细胞的功能，抑制炎症反应。丁hl细胞通过上调MHC一I和MHC一11的表达、激活巨噬细胞和内皮细胞、上调细胞粘附分子的表达、促进白细胞的募集和激活。心脏、’肾脏和肝脏移植术后发生排斥反应时血浆卫NF一a水平明显增高。器官移植的动物实验研究表明ThZ类细胞因子如IL一4和IL一10能使移植物长期存活，其机制可能通过下调致炎症因子的表达。IL一10通过降低MHC一H类分子、B7分子的抗原递呈作用，从而抑制T细胞的激活。因此本实验在建立大鼠肝移植模型的基础上采用转座元介导hlL一10基因，经门静脉灌注供肝，试图其在移植免疫排斥中的作用，并观察与比较常规免疫抑制剂的作用。目的:研究SB转座元系统转hIL一10基因诱导同种异体大鼠扦移植 南京医科大学博士学位论又杭排斥反应的机制。方法:采用“二袖套”法建立SD一Wi Sta:同种异体大鼠急性排斥模型，实验分组:1.对照组:未进行任何治疗n=6;2.空白DOTAP组:n二6;3.DOTAP组治疗组:n=6; 4.转座元介导hlL一10基因治疗组:n=6;5.FKSO6治疗组:n=6。术后Zd、4d、7d、14d眼眶采血，收集血清，生化检测转氨酶水平。ELI SA检测DOTAP组治疗组和转座元介导 hIL一10基因治疗组hIL一10表达，R卫PCR检测移植物内细胞因子mRNA。原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。同时观察各组大鼠肝移植后的生存期。结果:转座元介导hIL一10基因治疗组和FK506治疗组大鼠移植术获得长期存活。对照组及。OTAP组治疗组均呈H一111级排斥反应，而FK506及转座元介导hlL一10基因治疗组无排斥反应或轻度炎症细胞浸润。对照组和空白DOTAP组移植术后转氨酶明显高于SB转座元一hIL一10治疗组和FK506治疗组，RT一PCR和ELISA检测表明术后两周SB转座元-hIL10治疗组仍有高水平的IL一10的表达，高于DOTAP转基因组，ThZ类细胞因子IL一4在转座元介导hIL一10基因治疗组大鼠高表达，Thl类细胞因子IL一2和IFN一y在各实验组之间无明显差异。结论:比一10具有抗大鼠排斥反应的作用，延长大鼠生存期。其机理主要是通过过度表达的lL一10通过促进移植物内浸润T细胞凋亡而诱导特异性无反应性，抑制了免疫反应的识别阶段。 关健词:肝移植大鼠基因治疗细胞凋亡免疫耐受 南京医科大学博士学位论又第三部分不同冷缺血时间及转座元介导hll产10基因对大鼠部分肝 移植术后肝再生的影响 前言研究背景:肝脏移植作为治疗终末期肝病的主要用段在过去20年内取得重大进步，对供肝的需求在日益扩大，全球性的供肝医乏严重阻碍了肝移植的发展。劈裂式及活体肝移植为解决供肝来源问题开拓了新的途径，两者部分肝脏移植至受体体内均有不同时间的冷缺血时间，移植后?