背景和目的哺乳动物的乳腺是一种复管泡状腺，具有分泌乳汁的功能；是动物出生后唯一可以多次重复再生的器官。根据乳腺发育的特征，啮齿类动物乳腺大致可以分为六个发育期：胚胎期、青春期、性成熟期、孕期、哺乳期和退化期。在乳腺细胞分化过程中，往往由于高度分化而完全失去再生能力，最终导致细胞的衰老死亡；乳腺在发育进化过程中为了补偿这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，称为乳腺干细胞。乳腺细胞的增殖和分化始终贯穿于乳腺发育及泌乳全过程，人们在细胞水平上进行了大量的乳腺上皮细胞增殖及分化的研究。这些研究揭示乳腺干细胞再生乳腺和分化异常导致乳腺癌变的机制，为乳腺肿瘤和癌症预防及治疗提供理论依据，为研究器官形成和细胞分化机理提供合适的模型。乳腺干细胞研究的标记蛋白主要有CK5，Sca-1，α6-integrin，MUC~-／ESA~+以及CK19。合适的乳腺干细胞特殊标记物的讨论仍在进行。在各报道中所确定的鉴别乳腺干细胞的标记物不同，这是值得重视和进一步研究的现象。这种不同可能有多方面的原因：1．材料的来源不同；2．体内和体外培养研究方法的不同；3．乳腺干细胞及其微环境随着个体的发育也处于发育变化过程中；4．乳腺干细胞在建立复杂的调控机制、信号转导系统和特殊功能过程中表达一系列相关的蛋白。我们选取青春期、性成熟期、孕期、哺乳期的大鼠乳腺组织进行形态学研究，运用免疫荧光和免疫酶标记以及Western免疫印迹法，观察Sca-1，CD24，Muc1在大鼠乳腺发育四个特殊时期的表达，研究这三种细胞标记物的分布，以探讨乳腺干细胞的增殖和分化。方法1．乳腺组织石蜡切片的准备：6 w(体质量180～220g)、9 w(体质量210～230g)、孕15 d(体质量350～380g)、产后3 d(体质量330～350g)，每个时期1组，每组12只，乳腺组织块大小为1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，制成4μm厚切片。2．HE染色：研究乳腺发育四个时期的形态和小亮细胞的形态分布。3．免疫组化酶标记：研究Sca-1，CD24和Muc1在乳腺发育四个时期的抗原阳性情况。4．免疫荧光单标记：研究Sca-1，CD24，Muc1在乳腺发育四个时期的抗原阳性情况。5．Western免疫印迹法：取6 w、9 w、孕15 d、产后3 d的SPF级雌性大鼠，每个时期1组，每组3只，检测Sca-1，CD24，Muc1在乳腺发育四个时期的各自含量。6．免疫荧光双标记：Sca-1分别和CD24以及Muc1标记，观察它们在四个时期的双阳性情况。结果1．HE染色结果6 w雌性大鼠乳腺末端主要是端芽结构；9 w雌性大鼠乳腺主要是腺小叶。在孕15 d乳腺组织中，乳腺的中、次级导管分支大量增加，腺泡迅速发育且数量增多。在产后3 d的乳腺组织中，乳腺小叶充满分泌腺泡，腺泡上皮的形态多样，细胞内出现较多空泡，在细胞核与细胞的游离面之间的胞质中空泡特别多，小叶内导管明显可见，结缔组织中的血管较多，小叶间隔很薄。在6 w乳腺组织中，小亮细胞大多是数个或成群地分布，常位于乳腺分支导管及末端芽的基底部；在9 w乳腺组织中，小亮细胞分布于导管及腺泡的基底膜上，也部分位于肌上皮与腺上皮细胞之间；在孕15 d乳腺组织中，小亮细胞分布于小叶导管中；在产后3 d乳腺组织中，小亮细胞大多分布在分支导管中。2．免疫组化酶标记结果Sca-1~+细胞分别位于6 w雌性大鼠乳腺的脂肪细胞之间和腺泡周围；9 w雌性大鼠乳腺脂肪细胞之间和腺泡周围；孕15 d雌性大鼠乳腺脂肪垫的脂肪细胞之间表达；以及产后3 d雌性大鼠乳腺的脂肪细胞之间，输乳管和乳腺脂肪垫中。CD24~+细胞分别位于6 w雌性大鼠乳腺脂肪细胞之间；9 w雌性大鼠乳腺脂肪垫中；在孕15 d雌性大鼠乳腺腺泡周围；在产后3 d雌性大鼠乳腺的叶间导管。Muc1~+细胞分别位于6w雌性大鼠乳腺的脂肪细胞之间，孕15 d雌性大鼠乳腺脂肪垫中；以及在产后3 d雌性大鼠乳腺叶间导管。3．免疫荧光单标记结果9 w雌性大鼠叶间导管分别有Sca-1~+；CD24~+和Muc1~+细胞；产后3 d雌性大鼠母鼠乳腺分支导管分别有Sca-1~+；CD24~+和Muc1~+细胞。4．Western免疫印迹法结果Sca-1在6 w和9 w乳腺中的含量没太大变化，产后3 d大鼠乳腺的Sca-1含量比孕15 d的少，活动期间的2个乳腺发育时期的Sca-1含量比静止期的含量少。CD24在大鼠乳腺发育前6w，9 w和孕15 d三个时期含量没太大变化，而在产后3 d大鼠乳腺CD24含量变少。Muc1在乳腺发育活动期的2个时期含量比静止期的2个时期高。5．免疫免疫荧光双标记结果6 w雌性大鼠乳腺脂肪垫；9 w雌性大鼠乳腺脂肪细胞间；孕15 d雌性大鼠乳腺脂肪细胞间；以及产后3 d雌性大鼠乳腺脂肪细胞间均发现有Sca-1和CD24双阳性细胞。6 w雌性大鼠乳腺腺泡周围和分支导管；9 w雌性大鼠乳腺腺泡周围；孕15d雌性大鼠乳腺脂肪细胞之间以及产后3 d雌性大鼠乳腺分支导管存在Muc1和Sca-1双阳性细胞。结论1．活动期的乳腺上皮细胞在乳导管基质中广泛增殖，乳腺中、次级导管分支增加；腺泡迅速发育，数量增多且胞体变大。与静止期乳腺相比，这些明显变化应该是怀孕期间多种激素的作用结果；4个时期的生长增殖部位都出现小亮细胞。2．部分Sca-1阳性细胞可能代表一类腔祖上皮细胞，而且在不同时期含量是有变化的。3．关于乳腺干细胞的表面标志物在乳腺发育过程中可能有变化：(1)标志物性质的变化，即有不同标志物的保留或更替；(2)标志物表达量的变化。实验结果显示CD24在前三个时期含量没变化，在产后3 d发生变化可能是对称分裂发生的比较多，也可能是细胞横向分化，使得这个时期干细胞含量降低。4．Muc1在分泌乳汁的腺泡周围和导管内侧以及脂肪等多个部位表达，Muc1在乳腺发育活动期的2个时期含量比静止期含量高，它可能是成熟腔上皮细胞的标志。5．在乳腺发育时期，乳腺细胞(导管上皮细胞、腺泡上皮细胞、肌上皮细胞)大量扩增的主要来源有两种可能，可能Sca-1~+细胞具有双潜能，部分Sca-1~+细胞代表一类双潜能祖细胞。