结直肠癌(colorectal cancer, CRC)作为消化系统最常见的恶性肿瘤,全球每年新发病例超过120万,并且每年约有60万人死于CRC。手术切除原发性肿瘤是治疗结直肠癌的首选方式,但手术后因感染诱发的炎症反应及肿瘤远端转移是导致CRC患者预后较差的主要原因。肿瘤转移是一个多因素、多基因参与的过程,包括细胞与细胞间的粘附降低、细胞与细胞外基质的粘附能力增强、基质金属蛋白酶降解细胞外基质等。其中,细胞迁移和粘附是肿瘤迁移能力的重要指标。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作为革兰氏阴性菌外膜上的一种糖蛋白,可引起全身炎症反应和严重败血症,与CRC术后腹内感染并发症有关。结直肠癌患者手术后,LPS含量会明显上升并引起炎症反应。然而LPS在CRC进程中的明确作用目前仍不清楚。因此,研究CRC粘附、转移及炎症微环境改变诱导CRC恶性转化的分子机理,对减少CRC患者的发病率和死亡率具有重要意义。无论氧气存在与否,肿瘤细胞主要依赖糖酵解而不是氧化磷酸化进行葡萄糖代谢,这一糖代谢异常现象称为Warburg效应。目前认为,M2型丙酮酸激酶在Warburg效应中发挥着重要作用。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)作为糖酵解途径的限速酶,能够将磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸。PKM1和PKM2作为PK最为常见的两个亚型,由PKM基因经选择性剪接产生。PKM1蛋白主要在除了肝、肾和血红细胞之外的正常细胞中高表达,而PKM2蛋白则在干细胞和肿瘤细胞中高表达。PKM1具有稳定的四聚体结构,不受别构调节。PKM2受到别构调控,并在肿瘤细胞内发生二聚体和四聚体间转化。PKM2四聚体具有较高的丙酮酸激酶活性,而二聚体形式则具有蛋白激酶活性,两种活性的转换为肿瘤细胞提供生长优势和对微环境的适应能力。已有报道显示,PKM2在肿瘤细胞增殖、恶性转化、血管生成和细胞周期进展中发挥着重要作用。然而,PKM1和PKM2在结肠癌细胞粘附、转移及炎症微环境的作用仍不明确。本文通过构建稳定敲低PKM的DLD1细胞株以及稳定过表达PKM1、PKM2及PKM2不同活性突变体的DLD1细胞株,分别探讨了PKM1与PKM2在结肠癌细胞迁移与粘附、炎症因子分泌与增殖调控中的作用与机制；通过原核表达GST-PKM1、 GST-PKM2融合蛋白来模拟分泌型PKM1和PKM2,检测其对结肠癌细胞迁移能力的影响并探讨其作用机制。获得以下研究结果：1.通过构建敲低PKM、过表达PKM1、PKM2以及过表达PKM2的K367M、R399E和K433E等突变体的慢病毒表达载体。采用慢病毒包装、收获、转染结肠癌DLD1细胞,经puromycin筛选、qPCR和western blot技术检测,得到稳定细胞株。2.通过细胞划痕法和细胞基质粘附实验,我们发现过表达PKM2,而不是PKM1,能够明显促进结肠癌细胞迁移及粘附。qPCR和western blot结果显示,过表达PKM2能明显提高N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Snail-2的表达,促进FAK的磷酸化以及β1-integrin的活化,并抑制E-cadherin的表达。敲低PKM能明显逆转PKM2诱导的迁移粘附相关信号分子的表达。特别是过表达PKM2能够上调STAT3的mRNA水平、蛋白水平、磷酸化水平以及STAT3的核转位。放线菌素D实验显示,PKM2上调STAT3的表达主要是通过调控其转录水平,而不是通过抑制mRNA降解。在过表达PKM2的细胞株中瞬时敲低STAT3的表达,结果表明,敲低STAT3能够有效逆转PKM2诱导的迁移粘附相关信号分子的表达及细胞迁移。通过检测PKM2不同活性点突变的稳定细胞株中丙酮酸激酶活性、STAT3的表达和磷酸化水平以及细胞迁移能力,发现DLD1-R399E细胞缺乏丙酮酸激酶活性,能明显增加STAT3和磷酸化STAT3的表达,促进结肠癌细胞迁移。3.LPS可以明显促进DLD1细胞中PKM2、TNF-α、IL-1β的表达,并具有浓度依赖性,而PKM1的表达不受LPS影响。同时发现LPS可以促进DLD1细胞增殖。Western blot、qPCR、ELISA以及MTT结果显示,敲低PKM能够抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β的表达、分泌以及结肠癌细胞增殖。过表达PKM2可以明显促进TNF-αIL-1β的表达以及LPS诱导的结肠癌细胞增殖。NF-κB的抑制剂BAY-11-7082能够明显抑制LPS诱导的NF-κB亚基p65、PKM2的表达。敲低PKM能显著抑制LPS诱导的STAT3的表达和核转位,而对LPS诱导的p65的表达和核转位无影响。在过表达PKM2细胞中瞬时敲低STAT3,可以逆转由PKM2引起的TNF-a和IL-1β的表达。染色质免疫共沉淀结果显示,LPS能促进PKM2与STAT3启动子的结合,通过促进STAT3的转录来调控TNF-α、IL-1β的表达。DLD1-R399E细胞能明显促进STAT3的表达和]TNF-α、IL-1β的分泌。4.通过原核表达纯化GST-PKM1、GST-PKM2处理DLD1细胞模拟分泌型PKM1、PKM2的功能,发现分泌型PKM2能促进结肠癌细胞迁移。敲低PKM2能明显减少PKM2的分泌及由分泌型PKM2诱导的结肠癌细胞迁移。分泌型PKM2能促进MMP-2、MMP-9、N-cadherin、β、catenin勺表达,抑制E-cadherin的表达。分泌型PKM2能够促进Akt的磷酸化,而PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002能抑制分泌型PKM2诱导的结肠癌细胞迁移及E-cadherin、N-cadherin和β-catenin的表达。采用siRNA干扰β-catenin表达,可以明显逆转分泌型PKM2诱导的E-cadherin、 N-cadherin的表达。综上所述：PKM2依赖其蛋白激酶活性而不是丙酮酸激酶活性,调控STAT3转录,促进结肠癌细胞迁移和粘附。LPS通过诱导PKM2表达、增强PKM2与STAT3基因启动子结合、加强STAT3的表达与核转位,调控结肠癌细胞TNF-a和IL-1p的表达与分泌。分泌型PKM2能通过PI3K/Akt和β-catenin信号通路促进结肠癌细胞迁移。因此,PKM2在结肠癌细胞迁移、粘附、炎症因子的分泌调控中发挥着重要作用,可作为结直肠癌转移和术后炎症反应诊治的靶点。