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目的通过检测自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis, AIH)患者的外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞亚群和调节性T细胞表达,分析其与肝功能、免疫球蛋白和肝脏炎症活动指数(Hepatitis activity index, HAI)的相关性,了解淋巴细胞亚群在AIH发病中的作用机制,为AIH的诊治提供依据。对接受骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)移植治疗的AIH模型小鼠肝组织内CD3+细胞、干扰素-γ(Interferon-y, IFN-γ)、程序性死亡分子1(Programmed death-1,PD-1)、程序性死亡配体-1(Programmed death ligand-1, PD-L1)表达进行检测,初步探讨MSCs通过PD-1通路免疫调控治疗AIH的机制。方法1、选择确诊为AIH且未接受激素及免疫抑制剂治疗的患者20例,为AIH组,以20例健康成年人为对照组。两组分别进行肝功能指标(血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、γ-谷胺酰转移酶(y-glutamyltransferase,y-GT))、血清总胆红素(Total bilirubin,TBIL)、直接胆红素(Direct bilirubin,DBIL);免疫球蛋白(免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M, IgM)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA))的检测；AIH组行肝穿刺活组织病理检查,评价肝炎活动性指数HAI。应用流式细胞术分别检测两组外周血T、B淋巴细胞亚群表面标志的表达情况,并将淋巴细胞亚群比率与肝功能指标、免疫球蛋白及HAI评分进行相关性分析。2、以AIH模型小鼠接受MSCs移植治疗,分为MSCs治疗组、PBS对照治疗组和正常对照组,三组分别于造模时、治疗后1周、4周三个时间点取鼠肝组织。三组小鼠不同时间点肝组织样本数均为10个。用免疫组化方法检测各组小鼠各时间点肝组织内CD3+、IFN-γ、PD-1和PD-L1的表达情况。结果1.AIH患者外周血淋巴细胞亚群异常改变与肝功能、免疫球蛋白和肝炎活动指数的关系1.1AIH组外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD5+CD19+B细胞百分比及CD5+CD19+B/CD19+B细胞比值分别为46.00±16.84%、34.26±11.60%、13.6±5.55%、8.45±6.09%、0.62土0.15,均明显高于对照组的35.50±3.59%、25.21±2.89%、9.85±1.21%、2.84±0.92%、0.29±0.10,差异有统计学意义(P<0.05)。AIH组CD3+T细胞百分比、CD4+CD25+CD127dim T细胞百分比和CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞比值分别为64.23±13.24%、5.59±2.17%、1.30±±0.25,而对照组为69.38±4.32%、6.09±1.36%、1.42±0.19,两组相比差异无统计学意义(P0.05)。1.2AIH组ALT、AST、ALP、γ-GT、TBIL、DBIL分别为197.00±183.915U/L188.65±180.00U/L、189.30±38.10U/L、148.00±39.61U/L、87.88±114.88μmol/L、59.97±83.91μmol/L;正常对照组分别为25.65±10.80U/L、22.40±8.75U/L、90.85±35.51U/L、31.60±16.29U/L、13.90±10.90μmol/L、5.59±4.16μmol/L两组相比差异有统计学意义。AIH组IgG、gM、IgA,分别为1824.95±753.54mg/dL、141.13±63.04mg/dL、284.10±176.03mg/dL,正常组为1182.70±325.12mg/dL、165.20±90.23mg/dL.229.00±119.16mg/dL,两组IgG相比,有明显统计学差异(P<0.01)；而IgM, IgA,两组相比无统计学差异(P>0.05)。AIH组HAI评分为7.60±±4.51分。1.3AIH组CD3+CD4+T和CD3+CD8+T细胞百分比分别与血清ALT、AST、肝脏HAI评分呈正相关,相关系数r=0.896、0.879、0.763(P<0.01)和r=0.877、0.843、0.642(P<0.01),与ALP、γ-GT、TBIL、DBIL无明显相关性(P>0.05);AIH组患者的B细胞亚群CD5+CD19+B细胞百分比分别与肝功能指标ALT、AST呈正相关,相关系数r分别为0.486,0.450(P<0.05),与HAI评分呈正相关(r=0.544,P<0.05),与ALP、GGT、TBIL、DBIL无相关性(P>0.05)；CD5+CD19+B细胞比率与IgG呈显著正相关(r=0.802,P<0.01),与IgM、IgA无相关性(P>0.05)。2MSCs治疗后肝组织中CD3、IFN-γ、PD-1和PD-L1表达。2.1MSCs治疗组在造模时、治疗后1周、4周三个时间点CD3+细胞的百分比分别为36.00±5.07%、27.94±2.33%、21.58±4.60%,组内相比,差异具有统计学意义(P<0.05),治疗后1周、4周与造模时相比,CD3+细胞百分比分别下降了22%和40%。且在治疗后1周与4周时,MSCs治疗组与PBS治疗组组间相比,差异有统计学意义(t=3.784,P<0.05vs t=4.409,P<0.05)。2.2MSCs治疗组三个时间点IFN-γ阳性细胞百分比分别为30.06±5.19%、26.52±3.88%、20.86±3.35%,组内相比,差异具有统计学意义(P<0.05),在治疗后1周、4周两个时间点,与造模时相比,IFN-γ阳性细胞百分比分别下降了12%和31%。在治疗后1周与4周,MSCs治疗组与PBS治疗组组间相比,差异有统计学意义(t=3.182,P<0.05vst=4.679,P<0.05)。2.3MSCs治疗组三个时间点PD-1阳性细胞表达率分别为17.92±4.29%、13.24±2.71%、10.98±2.47%,组内相比,差异具有统计学意义(P<0.05),在治疗后1周、4周两个时间点,与造模时相比,PD-1阳性细胞百分比分别下降了26%和39%。在治疗后1周与4周,MSCs治疗组与PBS治疗组相比,差异有统计学意义(t=3.862,P<0.05vst=,4.289,P<0.05)。2.4MSCs治疗组三个时间点PD-L1阳性细胞百分比分别为3.12±1.19%、8.94±3.39%、12.38±4.20%,组内相比,差异具有统计学意义(P<0.05),在治疗后1周与4周,MSCs干预后,PD-L1阳性细胞表达,分别比造模时上升了1.9倍和3倍。同时,MSCs治疗组与PBS治疗组组间相比,差异有统计学意义(t=.-4.87,P<0.05vs t=6.15,P<0.05)。结论1、AIH患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD19+B细胞、CD5+CD19+B细胞百分比以及CD5+CD19+B/CD19+B细胞比值,较正常人明显升高；并且与AIH患者肝功能指标ALT、AST、IgG及HAI呈正相关关系,提示T、B淋巴细胞亚群的异常表达增高与肝损害程度相一致。2、AIH患者的调节性T细胞数量较正常人相比,并没有明显减少,说明调节性T细胞的数量变化在AIH的致病过程中并未发挥作用。3、AIH小鼠MSCs移植治疗后,肝组织中CD3+、IFN-γ与PD-1的阳性细胞表达率明显下降,而PD-L1阳性细胞表达率明显增高,说明MSCs可能通过抑制细胞因子表达及调控PD-1通路的免疫调节作用而具有治疗AIH的作用。