电化学免疫分析是电化学技术和免疫学相结合发展起来的具有选择性高、测定速度快、操作简单的一种分析技术,非常适合于癌症疾病的诊断。电化学免疫传感器就是将抗原或抗体生物识别分子作为敏感膜,通过电极式的传感转换元件把抗原抗体反应信号转换为可测的电信号的免疫传感器。目前,有关电化学免疫传感器的设计和构建的研究十分活跃,重点集中在传感器的灵敏度和信号增强两个方面。纳米材料具有比表面积大和生物相容性好的特点而被广泛应用于传感器敏感界面构建和电化学活性纳米探针的设计,从而达到增强电流型免疫传感器的分析性能,如降低分析物的检测限,提高测试方法的选择性和传感器的稳定性等。本文主要从纳米材料构建传感界面和电化学信号放大方法方面做了以下工作：1.基于多壁碳纳米管／普鲁士蓝／纳米金构建的电流型免疫传感器的研究采用恒电位溶出伏安法,分别将普鲁士蓝和纳米金沉积在多壁碳纳米管修饰的玻碳电极表面,成功构建了一种直接吸附抗体分子于多壁碳纳米管／普鲁士蓝／纳米金(MWCNT/PB/GNP)为敏感电极界面的无试剂型免疫传感器,达到了免疫分子的固定、免疫分子活性的保持以及电极表面和免疫分子之间能进行有效电荷传递的目的。利用MWCNT对电极表面进行修饰,可将其本身的物理化学特性引入电极界面,同时也会因为其小粒径、大比表面积效应和良好的导电性,显著提高氧化还原探针PB在电极表面的固载量和增强免疫传感器的电流响应；其次,电沉积的纳米金,不仅能固载抗体并保持其活性,还能阻止PB探针的泄漏和MWCNT/PB复合膜从电极表面脱落,从而提高了传感器的稳定性和寿命；此外,将氧化还原探针固定在电极表面,不仅操作简单,而且可以避免对被分析物的干扰。该传感器具有制备方法简单、响应快、稳定性好、检测限低以及线性范围宽等特点。2.基于Nafion-碳纳米管-球形二茂铁甲酸纳米复合物构建的电流型免疫传感器的研究采用超声溶剂置换的方法成功合成出具有电活性的球形二茂铁甲酸新型纳米粒子,借助于Nafion良好的成膜能力和多壁碳纳米管有助于增强传感器响应电流,从而提高其灵敏度的特性,成功构建了以Nafion-碳纳米管-球形二茂铁甲酸导电复合物膜为电极基底的无试剂型电化学免疫传感器。值得注意的是,基于二茂铁甲酸固有的电化学活性,Nafion-MWCNT-FcCOOH复合物可以直接给出电信号,其羧基经EDC/NHS舌化后与L-半胱氨酸(L-Cys)交联,L-Cys的巯基再键合沉积的纳米金,从而使复合物膜更加稳定；同时电沉积的纳米金对免疫分子具有独特的吸附能力,并且具有电子传导作用,既能阻止电活性探针从电极表面脱落,又能为免疫反应提供良好的生物相容性的微环境,使免疫分子能保持较高的免疫活性。因此,这种方法构建的传感器具有制备过程简单、灵敏度高、重现性、稳定性和选择性好的特点。该传感器对HCG的线性范围为0.05 mIU·mL-1～200 mIU·mL-1,最低检测限为0.015 mIU·mL-3.基于HRP/硫堇功能化纳米Si02为信号放大标记的电流型免疫传感器的研究纳米粒子放大标记能产生极大的信号增强作用,为构建超灵敏的生物传感器奠定了基础,生物耦合的纳米粒子在生物传感信号放大中具有巨大的潜在应用价值。在本实验中,我们构建了基于多酶-电子媒介体功能化纳米二氧化硅生物耦合物为信号放大标记的新型电化学免疫传感器,并成功用于肿瘤标志物癌胚抗原的超灵敏检测。在这种方法中,表面环氧功能化的二氧化硅纳米粒子,能有效地键合有氨基的电子媒介体(硫堇)、酶(HRP)和二抗(Ab2),获得电活性的多酶生物耦合物HRP/HRP-Ab2/Thi@SiO2信号探针。由于二氧化硅大的表面积能提高单一夹心免疫反应对电子媒介体硫堇和HRP的固载量而使该检测的灵敏度得到增强,所构建的电流型免疫传感器具有较高的灵敏度,对CEA检测的线性范围为0.02ng·mL-1～10 ng·mL-1,最低检测限为7.0 pg·mL-1。4.基于重氮化-耦合功能化生物耦合物为信号放大标记的新型电流型免疫传感器的研究本研究中,利用重氮化-耦合方法成功制备出具有电化学活性的生物耦合物纳米探针,并将其作为电化学信号增强试剂,构建了一种新型的电流型免疫传感器。该免疫传感器具有双重放大电化学信号的作用,一是大量结合于纳米探针中的酶HRP和电子媒介体硫堇通过夹心免疫反应模式被引入到电极表面,另一个就是HRP能显著增强H2O2对硫堇的氧化反应,从而产生增强的催化还原峰电流,因此,这种基于含电子媒介体耦合物放大信号的方法具有较高的灵敏度和超低的检测限,能够检测痕量的肿瘤标志物存在。该免疫传感器对肿瘤标志物CEA的检测限为0.7 pg.mL-1。5.基于电活性聚合物刷为信号放大标记的高灵敏电流型免疫传感器的研究作为电化学免疫标记试剂的电活性物质通常是小分子物质(如二茂铁、普鲁士蓝和金属等),在氧化过程中是单电子转移,即一个分子只产生一个电子转移,因此不是最灵敏的电活性物质。为了增强电化学响应信号和提高检测的灵敏度,首先用壳聚糖(CS)分散的多壁碳纳米管(MWCNT)复合物修饰在玻碳电极表面,再吸附纳米金,纳米金吸附蛋白A(PA),构建导电性好、比表面积大、生物相容性好的传感器仿生界面,并利用蛋白A的定向作固载作用固载俘获抗体癌抗体CA125；利用原子自由基聚合放大技术和电活性聚酪氨酸作为电活性信号放大标记,构建了具有双重放大效应的超灵敏易再生的新型电化学免疫传感器。与传统的夹心免疫方法比较,由于带有环氧基团的功能大分子PGMA修饰的纳米材料结合了大量的发生多电子转移的聚酪氨酸电子媒介体,可显著放大响应电流信号,因此该方法具有较高的灵敏度。