多菌灵是目前农业上用以防治粮食、蔬菜、水果及蘑菇等农产品真菌病害的一种主要杀菌剂。但是多菌灵大面积的反复施用,导致多菌灵的污染状况日趋严重。多菌灵在自然环境中的残留期较长,且在自然条件下不易降解。其大量和连续的使用也对环境起到了一定的消极作用。多菌灵生物降解研究对改善多菌灵污染具有重要意义。本研究经过分离筛选得到四株多菌灵降解菌,首先考察了其生长特性及降解特性,分析了其降解产物。其次对其所含多菌灵降解酶进行了克隆与表达,并对纯化酶的酶学特性进行了测定。在此基础上通过巯基封闭及氨基酸突变实验确定了多菌灵降解酶的活性位点和活性基团,阐明了酶降解机制。并进一步对该酶在土壤及蔬菜上的降解应用以及酶的固定化条件进行了考察。其结果对农药降解工程菌株的构建提供了理论基础并为多菌灵降解酶制剂的开发和应用具有重要的指导价值。具体内容包括:1.从多菌灵污染土壤中分离、筛选出4株多菌灵降解菌,经过形态学观察、生理生化指标测定及系统发育地位分析,将四菌株初步鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida sp.djl^-1B、假单胞菌Pseudomonas sp.djl-5、微细菌Microbacterium sp.djl-6F和农杆菌Agrobacterium sp.djl-8B。四菌株的生长特性测定结果显示,四菌株在温度25°C到37°C,p H值为6.0-8.0的条件下均生长良好,最适生长温度均为30°C,最适生长p H均为7.0。djl-6F在各温度和p H值条件下的生长速度均高于其他三菌株,而djl-8B在各温度和p H值条件下生长速度最慢。djl^-1B和djl-5B在各温度和p H值条件下生长状态相似。1%-2%Na Cl浓度为四菌株生长最佳盐浓度,当Na Cl浓度高于3%时四菌株的生长均表现出明显的受抑现象,Na Cl浓度过高或过低都对四菌株的生长产生不同程度的影响。菌株对抗生素抗性实验表明四菌株对头孢呋辛钠、头孢他啶、阿莫西林克拉维酸钾、马来酸阿奇霉素、克林霉素磷酸酯、头孢哌酮钠舒巴坦钠、头孢曲松钠、氨苄西林钠、青霉素钠、头孢噻肟钠、乳酸左氧氟沙星、硫酸庆大霉素十二种抗生素各表现出了不同程度的抗性。由于四菌株种属关系的异同所以表现出对环境适应性以及生长特性的差异。2.四菌株的降解特性及降解产物的检测结果可见,四菌株均可以多菌灵为唯一碳源生长并同时对多菌灵产生降解,其中djl-6F对多菌灵的降解率均高于其它三菌株,表现出明显的降解优势,而djl-8B则整体表现出较弱的降解能力。djl^-1B、djl-5B和djl-8B的最适降解温度为30°C,djl-6F的最适降解温度为35°C,在各温度条件下降解能力最强,最适温度下,96 h时降解率达99.5%。djl^-1B和djl-5B的最适降解p H为7.5,djl-6F和djl-8B的最适降解p H为7.0,当p H小于6.5或p H大于8.0均对四菌株的降解活性表现出一定程度的抑制。菌株djl^-1B、djl-5B和djl-6F在多菌灵浓度小于150 mg/L时,降解速率较高,当多菌灵浓度大于200 mg/L时,降解明显受抑,而djl-8B对多菌灵浓度最为敏感,在多菌灵浓度大于100 mg/L时,降解速率明显减慢。四菌株对多菌灵的降解产物中均检测到2-氨基苯并咪唑（2-AB）和2-羟基苯并咪唑（2-HB）,其中菌株djl-5B降解产物还检测到了苯并咪唑（BZ）,四菌株对多菌灵的降解过程中均未见邻苯二酚的检测信号。3.降解酶的定域表达结果可知,djl^-1B和djl-5B的多菌灵降解酶主要以诱导型胞内酶为主,djl-6F所含降解酶主要是以非诱导型的胞外酶为主,djl-8B所含降解酶主要是非诱导型胞内酶。使用特征引物对多菌灵降解酶基因mheI进行PCR扩增并测序分析,经比对,菌株djl-6F成功克隆得到792bp的多菌灵降解酶基因。将该基因片段克隆到p ET-28a（+）载体上,成功在E coli.中得到其融合蛋白的表达,通过钴离子亲和层析柱纯化后,得到纯化蛋白MheI-6F。酶动力学参数测定结果表明MheI-6F水解多菌灵的Km值为6.69±2.1μmol/L,kcat值为160.88±3.3 min^-1。MheI-6F在10°C到45°C的范围内酶活比较稳定,相对酶活可保持在80%以上,对多菌灵的最适降解温度为45°C。当温度升至70°C时,MheI-6F仅剩40.17%的酶活。MheI-6F在p H 5.0到p H 8.0的范围较稳定,相对酶活在80%以上,稳定性和降解活性均在p H 7.0时达到最高。MheI-6F在偏酸性介质（4.0⁷.0）中比偏碱性介质中（8.0¹0.0）稳定性更强。体系中添加1 mmol/L的金属离子和化学试剂均对MheI-6F的酶活产生了不同程度的影响,金属离子中Fe3+影响最大,添加后的相对酶活为77.66%,而添加K+、Mg²⁺、Zn²⁺、Li+、Mn²⁺和Ca²⁺后MheI-6F的相对酶活均在80%以上。β-巯基乙醇、吐温-20、EDTA对多菌灵水解酶MheI-6F的酶活有轻微的抑制作用,而SDS则对MheI-6F的酶活抑制作用较强,添加后的相对酶活仅剩余46.21%,叠氮钠和甘油对酶活几乎没有影响。MheI-6F对多菌灵的降解产物中仅检测到了m/z为134[M+H]+的碎片峰,说明MheI-6F是将多菌灵水解为2-氨基苯并咪唑（2-AB）的关键酶。巯基封闭实验结果表明,MheI-6F所含巯基经过封闭以后完全失活。Cys突变结果表明,MheI-6F中16位点和222位点Cys突变后其水解酶活性分别降为45.06%和64.51%,而62位点、140位点和165位点Cys突变后其水解酶活性几乎没有变化。16位点和222位点Cys双突变后,MheI-6F完全失去水解活性。由此可确定,位于16位和222位的半胱氨酸是MheI-6F在水解多菌灵的过程中产生主要贡献的活性氨基酸残基,水解活性基团为巯基。该结果为农药降解工程菌的建立提供了理论基础。4.多菌灵降解酶对三种土壤及蔬菜多菌灵污染的降解实验结果可见外源添加降解酶MheI-6F后农田土壤、果园土壤和大棚土壤中多菌灵的降解半衰期分别从8.15 d、8.93d和7.52 d,骤然缩短为56.80 min、63.58 min和50.22 min。在喷施MheI-6F降解酶后,芹菜、菠菜和油菜中多菌灵的降解半衰期分别从5.06 d、4.41 d和4.26 d骤然缩短为40.76min、36.86 min和31.50 min。充分说明降解酶MheI-6F在对土壤农药残留污染及果蔬采摘后农药残留的降解方面具有一定的应用价值。5.采用海藻酸钠和Ca Cl₂对降解酶MheI-6F进行了固定化,对其固定化条件进行了考察,单因素实验结果表明,用3%海藻酸钠、4%Ca Cl₂溶液固定化4h的多菌灵固定化酶酶活力最高,正交试验表明这三个因素中固定化时间对酶活影响最大。固定化酶与游离酶的酶活比较显示经固定化后多菌灵降解酶的最适温度增加了5°C,而最适p H向碱性方向偏移了1.0,酶的热稳定性和p H稳定性都比游离酶有明显的提高。这一系列结果对固定化多菌灵降解酶MheI-6F的实地修复应用提供了一定的理论基础。