昆虫触角内的气味结合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)可以特异性地结合和运输气味分子,是昆虫嗅觉感受的第一个环节,以OBPs为靶标筛选昆虫行为活性物质是反向化学生态学的重要研究内容。目前的研究表明,仅依靠传统的荧光竞争结合实验检测OBPs与气味分子的结合能力,缺乏对结合过程中更多特性,尤其是蛋白构象转变的检测,影响了OBPs作用机制的研究。同时,昆虫体内众多OBPs基因在不同生理状态下有序表达协同作用,是昆虫嗅觉特异性识别的重要基础。转录调控是基因表达调控的第一步,然而目前尚没有报道某些转录因子可以控制OBPs基因的转录,导致OBPs在嗅觉识别上的协同作用、OBPs表达与昆虫发育及环境变化之间的关系仍缺少分子生物学解释。以上问题也进一步限制了以OBPs为靶标的反向化学生态学的发展。为此,本项目以林业上重要害虫松褐天牛Monochamus alternatus Hope及其天敌花绒寄甲Dastarcus helophoroides(Fairmaire)为研究对象,对花绒寄甲触角内高表达的DhelOBP21与气味物质的结合机制进行分析,对松褐天牛触角内已经明确嗅觉功能的MaltOBP19的转录调控机制进行了探索。以期为探明昆虫OBPs与气味物质的结合机制及OBPs转录调控机理提供理论依据,为探索利用OBPs筛选高效诱剂的研制及基于嗅觉调控的害虫治理技术提供新的靶标。主要的研究结果如下:1花绒寄甲气味结合蛋白DhelOBP21与气味分子的结合机制克隆获得花绒寄甲DhelOBP21基因cDNA序列(GenBank登陆号为KF984184)。经qPCR进行时空表达谱分析,DhelOBP21基因主要表达在未交配期的花绒寄甲成虫触角内,随着交配和产卵行为的发生,触角内基因表达量呈显著下降趋势。利用计算机手段对DhelOBP21进行同源建模和分子对接。结果显示,DhelOBP21蛋白结构内部中心位置,存在一个开放的疏水性结合腔。结合腔的大部分区域为疏水非极性区域,仅在第67位(除去信号肽后)的丝氨酸残基处,由丝氨酸的羟基作用形成一个极性区域。设计突变蛋白,将丝氨酸(Ser67)突变为非极性氨基酸丙氨酸(Ala),以增强疏水作用,分别将84位异亮氨酸(Ile84)和119位苏氨酸(Thr119)突变为天冬酰胺(Asn),以减弱疏水作用。荧光竞争结合实验表明,配基体积大小是选择性结合的首要条件,蛋白与配基的结合主要依赖于疏水相互作用和范德华力,氢键在结合过程中没有起到增强结合能力的作用。DhelOBP21对配基的结合,并不是由某一个氨基酸决定的,而是受到构成结合腔的所有氨基酸共同影响,单个氨基酸的突变,导致了蛋白结合腔的大小和形状均发生改变,进而影响了与配基的结合能力。在酸性条件下,未突变蛋白DhelOBP21-WT对配基的结合能力普遍降低,增强结合腔疏水性的突变蛋白DhelOBP21-S67A对配基的结合能力普遍增强,被突变的极性区域可能在配基释放过程中发挥作用。2以花绒寄甲气味结合蛋白DhelOBP21为靶标筛选行为活性物质利用荧光猝灭、圆二色谱实验对蛋白与配基的结合特性进行进一步检测。在荧光竞争结合实验中与OBPs具有结合能力的12个配基中,5个配基与DhelOBP21蛋白之间的作用属于静态猝灭,即能够形成稳定的复合物,其余配基与DhelOBP21蛋白之间的作用属于动态猝灭,没有形成稳定的复合物。圆二色谱检测显示DhelOBP21蛋白溶液中的主要蛋白结构是α螺旋。中性环境下,部分配基的加入可以诱导蛋白溶液中的α螺旋含量升高,验证了DhelOBP21分子动力学模拟的结果。在某些配基的结合过程中,原本游离的N端逐渐形成α螺旋并向结合腔靠拢,像“盖子”一样将配基固定在结合腔内,且进一步稳定了以α螺旋为主要二级结构的蛋白构象。综合分析不同配基是否能够与蛋白形成稳定复合物及是否能够诱导α螺旋的含量升高两个因素,筛选到(+)-β-pinene进行Y型嗅觉仪行为选择实验。结果表明(+)-β-pinene对未交配期的花绒寄甲具有显著的引诱活性。沉默DhelOBP21基因后,花绒寄甲对(+)-β-pinene的趋性行为消失,说明DhelOBP21在花绒寄甲对(+)-β-pinene的识别过程中发挥了重要作用。3松褐天牛MaltOBP19转录调控机制克隆获得松褐天牛MaltOBP19基因上游启动子调控序列(948bp),提交至JASPAR数据库预测MaltOBP19基因启动子区的顺式作用元件,共预测10个转录因子100%相似的作用元件,共计38个作用位点。利用双荧光素酶实验和序列截短实验在果蝇S2细胞中鉴定不同序列长度启动子的活性,其中MaltOBP19启动子-515~-312区域存在增强转录活性的顺式作用元件。对该区域进一步分析发现,-474~-433之间存在抑制转录活性的顺式作用元件,-349~-312之间存在增强转录活性的顺式作用元件。该结果预示了MaltOBP19复杂的调控机制。根据JASPAR数据库预测结果和相关转录因子功能的研究报道,选择可能作用在-405~-349区域内的转录因子BarH1,进一步验证其对MaltOBP19启动子的调控作用。克隆获得了松褐天牛MaltBarH1基因,利用双荧光素酶报告分析系统和真核表达载体,在果蝇S2细胞中超表达MaltBarH1。超表达之后的细胞相对于对照组,启动子-405区域的转录活性受到显著抑制,说明MaltBarH1对其有负调控作用。同时获得体外MaltBarH1可溶性重组蛋白进行EMSA实验,结果显示MaltBarH1可溶性重组蛋白可以与探针结合,形成滞后带,且其滞后现象可以被冷竞争探针完全抑制,说明探针迁移滞后是由于MaltBarH1重组蛋白与探针的互作导致的。该结果通过体外实验初步证明了转录因子MaltBarH1对MaltOBP19基因启动子序列的转录调控作用。综上所述,对OBPs嗅觉功能的研究及以其为靶标进行行为活性物的筛选,需要依靠更多的结合特性数据,及基于结合机制的蛋白构象转变的分析,有助于更为准确地研究OBPs与气味分子的作用特点,提高活性物质的筛选效率。初步鉴定到转录因子MaltBarH1对MaltOBP19的转录具有调控作用,该研究是OBPs基因表达调控研究的基础工作,将为深入了解昆虫OBPs基因时空表达与嗅觉功能的相关性奠定分子生物学基础,且随着RNAi技术在农业害虫防治中的发展,以OBPs转录因子为靶标,将是干扰昆虫嗅觉反应的新选择。