论文部分内容阅读
瑞芬太尼是临床中较为常用的新型超短效μ型阿片受体激动剂,在组织和血液中可以被非特异性酯酶迅速水解,故安全可靠,起效快,可控性好,作用强。在临床镇痛中发挥重要作用,患者发生呼吸抑制和复苏延迟的风险均较低,但同时可能诱发痛觉过敏,限制其使用。阐明其痛敏机制有助于制订有效的防治措施。有研究证实,神经连接蛋白-1/神经轴突蛋白-1α（Neuroligin-1/Neurexin-1α）可调控突触神经递质释放和突触后膜效应受体功能,参与突触形成和可塑性改变,在痛觉机制的调控中具有重要作用。Neuroligin-1/Neurexin-1α通过介导谷氨酸能兴奋性神经突触的形成,调控AMPA受体功能活化,从而维持突触效能及信息传递。课题组前期研究表明,瑞芬太尼所致痛觉过敏大鼠脊髓神经元含GluR1亚基的AMPA受体表达膜蛋白表达水平及转运增加,因此,推测Neuroligin-1/Neurexin-1α很有可能通过调节AMPA受体的膜转位,影响兴奋性神经突触的形成,进而参与了瑞芬太尼痛觉过敏中AMPA受体活化。本研究拟探讨Neuroligin-1/Neurexin-1α在瑞芬太尼切口痛大鼠模型中痛觉过敏的作用机制。目的:检测Neuroligin-1和Neurexin-1α在瑞芬太尼诱发切口痛痛觉过敏大鼠脊髓背角中的表达情况,评价其作用。方法一:取雄性SD大鼠（32只）,23月龄,体重约250g,采用随机数字表法分组,共4组:C组:静脉输注生理盐水(0.1 ml kg-1min-1,1h);R组:静脉输注瑞芬太尼(1μg·kg-1·min-1,1h);I组:经尾静脉置管输注生理盐水(1.0μg·kg-1·min-1,1h),并造足底切口痛模型;R+I组:经尾静脉置管输注瑞芬太尼(1.0μg·kg-1·min-1,1h),并造足底切口痛模型。在静脉输注瑞芬太尼、生理盐水的前1d及输注后的2h、6h、1d、2d、3d、5d和7d分别采用热缩足潜伏期（PWL）和机械缩足反应阈（PWT）进行痛敏检测。对2d疼痛行为学检测结束后将大鼠用脊髓脱臼法进行处死,取脊髓背角,采用蛋白质印迹法测定脊髓背角Neuroligin-1、Neurexin-1α、mGluA1、tGluA1和m/tGluA1的表达水平。方法二:将55只健康雄性SD大鼠随机分为5组（n=11）,具体分组为:对照组（C组）:尾静脉置管输注生理盐水,0.1 ml·kg-1·min-1,1h;生理盐水静脉输注+Neuroligin-1-shRN鞘内注射组（C+NL1-shRNA）:鞘内置管并注射Neuroligin-1-shRNA（10μL;3×108 transducing units[TU]/mL）,检测转染成功后,尾静脉输注生理盐水0.1 ml·kg-1·min-1,1h;手术+瑞芬太尼组（IR组）:尾静脉穿刺置管输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,1h,,同时造大鼠足底切口痛模型;手术+瑞芬太尼+Negative control-shRNA鞘内注射组（IR+NC-shRNA组）:鞘内置管,并将NC-shRNA注入体内,建立瑞芬太尼切口痛模型。手术+瑞芬太尼+Neuroligin-1-shRNA鞘内注射组（IR+NL1-shRNA组）:鞘内置管,并将NL1-shRNA注入体内,建立瑞芬太尼切口痛模型。在静脉输注瑞芬太尼、生理盐水的前1d及输注后的2h、6h、1d、2d、3d、5d和7d分别测定PWT和PWL。于48h痛阈测量结束后将大鼠用脊髓脱臼法进行处死,取脊髓背角,采用蛋白质印迹法测定脊髓背角Neuroligin-1、mGluA1、tGluA1和m/tGluA1的表达水平。于48h痛阈测量结束后将大鼠用脊髓脱臼法进行处死,取脊髓背角,应用高尔基染色试剂盒进行染色,对树突棘形态进行分析。结果一:各组大鼠尾静脉输注的前1d,PWT结果之间无统计学差异;与输注液体前1d的基础值相比,I、R、IR组的PWT于输注液体后2h、6h、1d、2d、3d、5d明显下调,静脉给药后2d时下调最为显著。与C组相比,I、R和IR组的PWT明显降低（P<0.05）,但I组与R组之间无显著差异（P>0.05）;相比于I组和R组,IR组各时点PWT明显减低。于液体输注后2h,脊髓背角Neuroligin-1和Neurexin-1α表达上调（P<0.05）。与R组、I组比较,R+I组PWT降低,PWL缩短,脊髓背角Neuroligin-1和Neurexin-1α表达上调（P<0.05）。结果二:与对照组比较,IR组、IR+NL1-shRNA组和IR+NC-shRNA组的PWL和PWT明显下调（P<0.05）;与IR组比较,IR+NL1-shRNA组PWL和PWT显著增加（P<0.05）;但与C组比较,C+NL1-shRNA组的PWL和PWT变化无统计学差异（P>0.05）;IR组与IR+NC-shRNA组的PWL和PWT各时间点之间差异没有显著性改变（P>0.05）。转染NL1-shRNA后的大鼠脊髓背角水平Neuroligin-1的表达量显著下降（P<0.05）;而转染NC-shRNA后的大鼠脊髓背角水平Neuroligin-1蛋白表达量的变化并没有显著性改变（P>0.05）。IR组与IR+NL1-shRNA组造模后2d大鼠脊髓背角含mGluA1的AMPA受体较对照组表达升高（P<0.05）,tGluA1表达升高,m/t GluA1比值上升（P<0.05）;IR+N1-shRNA组造模2d大鼠脊髓背角mGluA1的AMPA受体较IR组表达减少（P<0.05）,tGluA1表达减少,m/t GluA1比值下调（P<0.05）。与C组比较,IR组大鼠脊髓背角水平树突棘数量较对照组显著增多（P<0.05）;且树突棘长度较对照组显著变长（P<0.05）;而IR+Neuroligin-1-shRNA组大鼠脊髓背角较IR组的树突棘数量显著下降（P<0.05）,且树突棘长度明显缩短（P<0.05）。结论:Neuroligin-1和Neurexin-1α表达增加可能参与了瑞芬太尼切口痛大鼠脊髓背角痛觉过敏的形成和维持。抑制脊髓水平Neuroligin-1的表达对瑞芬太尼切口痛所致机械痛敏和热痛敏具有拮抗作用,这可能是通过其下调大鼠脊髓背角GluA1亚基的AMPA表达,影响受体合成和运输,从而实现其抗RIH效应。瑞芬太尼麻醉可能是通过脊髓背角内Neuroligin-1合成增加,进而调控树突棘结构的重塑,导致RIH的形成。