呕吐毒素抑制猪肠上皮细胞增殖和干细胞扩增的机制研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jmdwj
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
呕吐毒素化学名称是脱氧雪腐镰刀菌烯醇,由镰刀菌属产生,是世界上污染程度最广的霉菌毒素之一。猪是对呕吐毒素最敏感的家畜。肠上皮是呕吐毒素作用的靶器官之一,呕吐毒素通过扰乱肠上皮的更新进程,从而破坏肠上皮结构和功能。肠上皮更新的动力来源于肠道干细胞,因此本研究提出假设,低剂量呕吐毒素短时间处理可抑制猪肠上皮细胞的增殖和猪肠道干细胞的扩增。为验证该假说,从以下五个方面开展研究:试验一:以IPEC-J2细胞(an epithelial cell line derived from newborn piglet jejunum)为试验材料,研究呕吐毒素的剂量和处理时间对猪肠上皮细胞增殖、屏障和目的蛋白表达的影响。500 ng/mL呕吐毒素处理2 h可显著抑制(P<0.05)IPEC-J2细胞增殖,对单层IPEC-J2细胞的跨膜电阻值和通透性无显著(P>0.05)影响,下调(P<0.05)沉默型肠道干细胞标记基因Bmi1(B cell specific moloney murine leukemia virus insertion site 1)、PCNA(proliferating cell nuclear antigen)、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的表达水平,上调(P<0.05)Axin2的表达水平。以上结果提示,低剂量呕吐毒素短时间处理抑制细胞增殖,Wnt/β-catenin信号通路可能参与该过程。试验二:为研究呕吐毒素短时间处理对仔猪小肠上皮形态结构、屏障功能和目的蛋白表达的影响,选择5 d哺乳仔猪,对照组和呕吐毒素组仔猪分别口服0和0.3 mg/kg体重(BW,body weight)的呕吐毒素,2 h后行空肠结扎术评价荧光素钠吸收。与对照组相比,呕吐毒素组血浆中荧光素钠的含量无显著(P>0.05)变化,空肠隐窝明显肥大。Western blotting结果显示,呕吐毒素组Bmi1、ZO-1、Occludin、mTOR(mammalian target of rapamycin)、S6K1(ribosomal S6 protein kinase 1)、phospho(p)-S6K1、e IF4E(eukaryotic initiation factor 4E)、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的表达水平显著降低(P<0.05),GSK3β(glycogen synthase kinase 3β)显著上调(P<0.05)。以上结果提示呕吐毒素短时间处理可能对猪肠道干细胞产生不利的影响。试验三:为建立猪肠道干细胞体外培养方法及相关的评价技术,主要包括以下几个实验:(1)首先在显微镜下观察1 d仔猪小肠的隐窝绒毛轴结构,初步制定分离隐窝单位的策略;(2)比较不同日龄仔猪隐窝单位的大小,最终选择5 d仔猪用于后续的研究;(3)通过总结和分析三种不同分离方法的隐窝单位质量和所需时间,对猪小肠隐窝单位的分离方法进行优化,优化后的方法可在较短的时间内获得结构完整、纯度高达95%的隐窝单位;(4)在此基础上建立了猪隐窝单位的体外三维培养体系,还研究证明了在培养中后期加入Cdx2(Caudal type homeobox 2)条件性培养基可显著提高(P<0.05)猪类肠团(enteroid)形成效率和出芽效率;(5)在隐窝单位培养体系的基础上添加Jagged-1,可用于猪隐窝细胞的培养;(6)通过流式细胞术,用Draq7染料和CD24、CD44、CD166抗体,分选获得CD44+CD24lowCD166+的细胞群,在体外三维培养条件下该细胞群可有效地扩增成为类肠团,表明该细胞群富集猪肠道干细胞;(7)建立了慢病毒感染隐窝细胞、MTT测定类肠团扩增能力、类肠团免疫荧光染色等实验方法。首次成功建立了猪肠道干细胞研究的技术体系,为机制研究奠定基础。试验四:为研究呕吐毒素对猪肠道干细胞扩增能力的影响,一方面,选择5 d仔猪,口服0(对照组)和0.3 mg/kg BW(呕吐毒素组)呕吐毒素,处理2 h采集对照组和呕吐毒素组小肠隐窝单位,进行体外三维培养;另一方面,采集正常5 d仔猪小肠隐窝单位,消化成隐窝细胞,体外三维培养5 d后分别添加不同浓度呕吐毒素处理2和24 h。结果表明,在体呕吐毒素处理2 h后显著降低(P<0.05)猪类肠团形成效率和出芽效率,体外250和500 ng/mL呕吐毒素处理24 h极显著抑制(P<0.01)猪类肠团的出芽效率;EdU结果显示,500 ng/mL呕吐毒素处理2 h明显抑制类肠团扩增能力,降低Bmi1的荧光强度,下调(P<0.05)活跃型肠道干细胞标记基因Lgr5(leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5)的蛋白水平。以上结果提示,呕吐毒素在体和体外短时间处理均可抑制猪肠道干细胞的扩增能力。试验五:为了进一步挖掘呕吐毒素短时间处理对猪肠上皮增殖和干细胞扩增的作用机制,选择试验二中对照组和呕吐毒素组仔猪空肠样品各3个,进行iTRAQ蛋白质组学和生物信息学分析。共检测到蛋白总数为5175,差异表达蛋白94个,其中上调蛋白69个、下调蛋白25个。差异蛋白富集的生物进程主要包括细胞通讯、信号传导调节、应激反应、细胞分化、细胞凋亡进程调节和细胞增殖调节,富集的细胞组分主要包括细胞质囊泡、分泌小体、细胞膜以及顶膜。KEGG分析结果显示,富集的信号通路为PI3K(phosphoinositide 3-kinase)/Akt信号通路、JAK(Janus kinase)/STAT(signal transducers and activators of transcription)信号通路、细胞内吞作用和ABC(ATP-binding cassette)转运载体。以上结果说明,呕吐毒素短时间处理不影响猪肠道屏障功能,但显著抑制猪肠上皮细胞增殖和肠道干细胞扩增。其作用机制与ABC transporter、PI3K/Akt/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路和Wnt/β-catenin信号通路有关。研究成果为揭示呕吐毒素损伤猪肠上皮更新的机制以及猪肠道干细胞的相关研究奠定基础。
其他文献
目的通过递增负荷运动训练观测大鼠血清、骨骼肌和心肌组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧(ROS)的含量变化。方法采用递增负荷强度游泳大鼠建立力竭运动训练模型检测
手性自组装体可在调节其官能团结构或分子间弱相互作用方式下形成纳米管状、螺旋状、扭曲状、纳米纤维状等独特的手性结构,这些手性自组装体结构具有多样性,并且具有较高的力
患者女,50岁.因双眼干燥、微痛、视力模糊一周于2002年4月入住眼科,住院号45221,入院后第五天发现左眼角膜下方穿孔,直径0.5mm,诊断为"双眼角膜干燥征,左眼角膜溃疡、穿孔".
目的:探讨对行腹部手术的老年患者使用瑞芬太尼与芬太尼进行静脉麻醉的效果。方法:选取近几年在我院进行腹部手术的224例老年患者作为研究对象。随机将这些患者分为观察组和对
目的:探讨对严重创伤患者进行整体急救护理的临床效果。方法:将2015年6月至2016年3月期间皖南医学院弋矶山医院急诊科收治的162例严重创伤患者作为研究对象。将这162例患者随机
目的通过测定睾丸体积和血清FSH值,预测睾丸抽吸取精结果。方法依据睾丸体积及血清FSH值,将患者分A、B、C三组行睾丸抽吸,在倒置显微镜下寻找精子。采用x2检验比较各组获取精