背景:阻塞型睡眠呼吸暂停低通气综合症（obstructive sleep apnea/hypopeasyndrome,OSAHS）是具有一定潜在危险的疾病,它对机体的影响复杂而广泛,除直接的呼吸系统损害外,尚可导致心脑血管疾病。间歇低氧（Intermittenthypoxia,IH）是OSAHS所具有的、独特方式的低氧,其特点是:反复发生的低氧间期在20～120秒间、两次低氧间期血氧回到正常水平,这种缺氧/再氧合可能会出现某些类似于缺血/再灌注过程中所出现的病理改变。研究表明,间歇低氧不同于持续低氧,IH可能启动了与持续低氧不同的细胞内信号传导机制,导致机体产生多方位的损害。新近研究也表明,IH较易累及心血管系统诱发多种高危并发症的发生,是心脑血管疾病发生的潜在的重要独立危险因素,OSAHS患者与动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）的发病率密切相关,究竟OSAHS的IH作用机制是否影响AS的形成目前并不清楚。目的:模拟人类OSAHS间歇低氧状态建立AS形成的动物模型,探讨间歇低氧状态对AS形成的影响。应用基因芯片技术筛选腹主动脉粥样硬化形成的差异表达基因和构建高脂间歇低氧兔肝抑制差减cDNA文库,研究筛选间歇低氧状态下AS形成过程中肝脏的相关基因的差异表达变化,探讨IH状态下AS形成的可能分子机制,为AS干预治疗提供理论基础。方法:选用健康实验兔24只,雌、雄性各半,2～4个月龄。根据基础饲料喂养、高脂饲料（high fat diet,HFD）喂养、间歇低氧干预条件,将24只实验兔随机分4组。IH组6只（基础饲料+间歇低氧）、HFD组6只（高脂饲料）、HFD+IH组6只（高脂饲料+间歇低氧）、C组6只（基础饲料饲养作为对照）。适应性喂养标准基础饲料1周后,实验兔称重,并从每只实验兔耳缘静脉取空腹血2ml测定血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、低密度脂蛋白-胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）。动物造模实验期间,每天9:00Am～5:00PM将IH组、HFD+IH组实验兔置于间歇低氧舱内。通过控氧仪监测间歇低氧舱内的氧浓度来程控输气和排气。向间歇低氧舱内循环充入氮气（N₂）和空气混合气体（90%N₂和10%O₂）,在电路控制下分别以2L/min的流速输入,每次循环8分钟,即4分钟充入氮气,维持舱内氧气最低浓度达8.5%,维持时间1分钟,随后2分钟排出舱内混合空气,使舱内氧浓度恢复到21%维持1分钟,至下一循环,以此条件控制间歇低氧状态。每天除实验时间外,C组、IH组、HFD组、HFD+IH组实验兔生活环境均相同。12周后,处死实验兔,从主动脉起始部至腹主动脉分叉处全程解剖暴露,观察其主动脉粥样硬化情况,分别剪取各组实验兔主动脉,甲醛固定制成石蜡切片,用于HE染色和苏丹Ⅲ染色。另一部分迅速冻存于液氮罐中,-70℃超低温冰箱备用。同时,观察腹主动脉、心、肝脏、肺等器官病理组织学改变。提取HFD组、HFD+IH组、IH组实验兔腹主动脉总RNA,逆转录制备杂交探针,与采用美国Affymetrix公司Human Cardiovascular Disease Gene ArrayⅡ（HS-038）芯片杂交,杂交信号经ScanArray4000S扫描后用Microarray SuiteVersion 5.0软件分析。采用RT-PCR方法验证部分差异表达基因。提取HFD组和HFD+IH组肝脏mRNA,巢式PCR扩增合成双链cDNA（dscDNA）,纯化dscDNA,RsaⅠ酶切dscDNA,将PCR产物与T/A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,挑选阳性克隆进行PCR扩增鉴定。取阳性克隆抽提质粒用于模板进行PCR扩增。在经过两轮差减杂交和两次抑制性PCR得到两者之间差异表达的cDNA。用α-³²p标记的PFD组、PFD+IH组cDNA为探针,分别与相同的用阳性克隆PCR产物制备好的杂交膜进行反向Northern Dot Blot杂交,放射性显影,杂交信号经扫描后,用ScanAlyze软件进行分析,对杂交信号存在2倍差距的克隆进行标记。挑取12个差异明显的克隆进行测序,将测序结果与NCBI数据库进行同源性匹配分析。定量荧光PCR验证实验兔肝脏相关差异基因。结果:1.IH状态下实验兔体重的变化。实验兔适应性喂养1周后,对各组实验兔进行体重称量,HFD组体重为2.201±0.226kg、C组体重为2.102±0.234 kg、IH组体重为2.301±0.347 kg、HFD+IH组体重为2.212±0.126 kg,组间比较差异无统计学意义,结果说明本实验中所选用的实验兔体重具有相对均一性,为后续的建立动物模型实验建立了相同的起始条件。在给予间歇低氧干预因素后的,设定以每6周为时间段定期观察测量兔子体重变化。HFD组、HFD+IH组、IH组实验兔和C组间比较,差异无统计学意义（p＞0.05）。在实验的第12周,各组实验兔的体重较实验的第6周均增加,HFD组和HFD+IH组实验兔体重高于IH组和C组实验兔,但差异无统计学意义（p＞0.05）。IH状态对于实验兔体重无影响。2.实验兔血清血脂指标的变化。在实验前各项指标组间差异无统计学意义（p＞0.05）。随高脂饲料的添加和喂养时间的延长,在6周和12周,HFD组和HFD+IH组TC、TG和LDL-C水平高于C组,差异有统计学意义（p＜0.05）。HFD组和HFD+IH组TC、TG和LDL-C水平高于IH组,差异有统计学意义（p＜0.05）。但C组和IH组差异无统计学意义（p＞0.05）。3.IH组实验兔在间歇低氧舱低氧最低点动脉血氧分压为20.9mmHg～29.7mmHg,最低血氧饱和度范围为31.2%～58.3%,恢复舱内氧浓度至21%后,测得动脉血氧分压为71.6mmHg～106.4mmHg,动脉血氧饱和度为92.2%～97.4%,符合人类OSAHS的血氧饱和度诊断标准（SaO₂＜80%）。4.IH状态下腹主动脉大体标本观察AS的形成存在差异。C组实验兔腹主动脉柔软,内膜光滑无粥样病损,无脂质斑块形成;IH组只一例在腹主动脉处发现有3mm长的脂纹;HFD组和HFD+IH组肉眼见病变较弥漫,多累及整条腹主动脉,大多呈条索、块状连成片分布,色灰黄,明显突出于主动脉内膜表面;血管壁增厚、僵硬,内壁有黄白色脂纹及隆起状脂斑,呈灶状、条索状及不规则的小片状分布。高脂饲养的实验兔在IH状态下更容易发生AS病变。5.IH状态下的腹主动脉组织HE染色后镜下观察结构存在明显差异。C组主动脉壁内膜连续光滑、内膜下未见泡沫细胞、中膜、外膜均清晰可见,各层结构正常,无脂质沉积。IH组血管内膜内可见连续性中断结构紊乱。HFD组和HFD+IH组腹主动脉光镜下可见内皮细胞脱落缺失,平滑肌细胞减少。多层泡沫细胞紧贴内弹力板堆积,部分填充于中层泡沫细胞,镜下,内皮下有较多泡沫细胞聚集,脂质类似物游离于细胞外,形成粥样斑块。IH组和HFD+IH组标本镜下观察存在显著性差异。此结果说明在IH状态下AS容易形成,6.IH状态下心肝肺等重要脏器容易受累。C组实验家兔心肌组织结构正常,间质中无炎性细胞浸润。HFD组、IH组、HFD+IH组心肌细胞肿胀,胞浆呈颗粒凝聚且分布不均匀,间质水肿,可见炎性细胞浸润,灶性间质纤维化,心肌纤维排列紊乱,心肌细胞水肿。C组肺组织结构清晰,肺小动脉血管壁薄;HFD组、IH组、HFD+IH兔肺组织中可见炎症细胞浸润,肺小动脉横切面细胞数增加,肺小动脉血管壁普遍增厚,管腔明显狭窄。7.各组实验兔腹主动脉内膜、中膜厚度比较。C组、IH组、HFD组、HFD+IH组腹主动脉内膜厚度分别为:（5.57±1.15）μm、（32.6±7.91）μm、（43.6±2.67）μm、（76.4±12.32）μm。IH组、HFD组、HFD+IH组与C组组间比较,差异具有统计学意义（p＜0.05）;HFD+IH组与IH组、HFD组组间比较,差异具有统计学意义（p＜0.05）;但IH组和HFD组组间比较差异不具有统计学意义（p＞0.05）,C组、IH组、HFD组、HFD+IH组腹主动脉内膜和中膜厚度比值分别为:（4.57±1.23）%、（25.4±1.21）%、（29.2±1.35）%、（76.4±1.03）%。IH组、HFD组和HFD+IH组与C组组间比较,差异具有统计学意义（p＜0.05）;HFD+IH组与IH组、HFD组组间比较,差异具有统计学意义（p＜0.05）;但IH组和HFD组组间比较差异不具有统计学意义（p＞0.05）。8.各组实验兔腹主动脉脂纹脂斑面积与血管面积百分比较。C组、IH组、HFD组、HFD+IH组腹主动脉脂纹脂斑面积与血管面积百分比结果显示:C组（0.51±0.14）%、IH组（1.25±0.32）%、HFD组（42.37±12.45）%、HFD+IH组（74.36±11.36）%。IH组、HFD组和HFD+IH组与C组组间比较,差异具有统计学意义（p＜0.05）;HFD+IH组与IH组、HFD组组间比较,差异具有统计学意义（p＜0.05）;但IH组和C组组间比较差异不具有统计学意义（p＞0.05）。9.HFD+IH组/HFD组（组一芯片）相比中共有131条基因表达上调,93条基因表达水平下调。在HFD+IH组和IH组（组二芯片）相比中共有56条基因表达上调,52条基因表达水平下调。按细胞信号传导、免疫炎症反应、细胞外基质降解、凝血纤溶、细胞凋亡、平滑肌细胞相关、癌基因或抑癌基因、细胞运动等功能分类,共筛选共同差异基因46条;其中上调基因29,下调基因17条。HFD+IH组/HFD组（组一芯片）和HFD+IH组和IH组（组二芯片）平行比较显示共同的差异2倍以上基因共有20条;其中细胞凋亡相关基因3条;细胞信号转导相关基因5条;免疫相关基因6条;细胞骨架和运动相关基因2条;代谢相关基因3条;蛋白质合成相关基因1条。组一芯片和组二芯片相比中共有17条基因表达水平下调。按细胞信号传导2条;免疫炎症反应1条;细胞外基质降解4条;凝血纤溶2条;细胞凋亡3条;平滑肌细胞相关2条;癌基因或抑癌基因1条、细胞运动2条。提示IH状态下AS的形成是多基因参与的发生发展过程。10.基于基因芯片的结果,选择炎症相关基因IL-8、COX-2在C组、IH组、HFD组和HFD+IH组的腹主动脉组织中采用RT-PCR方法进行验证。结果显示,HFD+IH组和HFD组腹主动脉组织中IL-8 mRNA的平均表达水平明显高于IH组、C组（2.43±0.41 vs 1.97±0.23 vs1.27±0.11 vs 0.47±0.17）。HFD+IH组和HFD组腹主动脉组织中COX-2 mRNA的平均表达水平也明显高于IH组、C组（2.37±0.59 vs 1.79±0.21 vs1.35±0.07 vs 0.57±0.09）,差异有统计学意义（p＜0.05）。将IH组、HFD组IL-8 mRNA表达水平与腹主动脉内膜病理学变化进行相关性分析发现:①IH组腹主动脉内膜表达的IL-8 mRNA表达水平与斑块面积、内膜厚度、内膜/中膜厚度比值具有显著性相关性:（0.903、0.875、0.896,p＜0.05）,②HFD组腹主动脉内膜表达的IL-8 mRNA表达水平与血清LDL-C、斑块面积、内膜厚度、内膜/中膜厚度比值具有显著性相关性:（0.923、0.814、0.821、0.877,p＜0.05）。将IH组、HFD组COX-2 mRNA表达水平与腹主动脉内膜病理学变化进行相关性分析发现。①IH组腹主动脉内膜表达的COX-2 mRNA表达水平与斑块面积、内膜厚度、内膜/中膜厚度比值具有显著性相关性,（0.927、0.867、0.853,P＜0.05）,②HFD组腹主动脉内膜表达的COX-2 mRNA表达水平与血清LDL-C、斑块面积、内膜厚度、内膜/中膜厚度比值具有显著性相关性,（0.852、0.945、0.875、0.896,P＜0.05）。以上结果提示IH介导的炎症反应可能是AS形成的主要机制。11.第二轮抑制性PCR产物连接pMD19-T载体,转化大肠杆菌,经蓝白筛选后随机挑取300个阳性克隆,以接头1和2R内侧序列为引物进行菌液PCR扩增鉴定阳性克隆。正、反抑制差减杂交分别获得325个和反向244个阳性克隆,阳性率为96%。大小分布在100-600bp的插入片断,说明质粒插入片断各不相同。12我们挑取12个差异明显的克隆进行测序,将测序结果与NCBI数据库进行同源性匹配分析,得到2个已知基因（PC4、COX2、MYL6、HDAC7）,2个与基因组contig序列同源的序列和3个未找到同源基因的新序列,其中2个克隆测序为相同片段,1个克隆未测出序列。对2个与基因组contig序列同源的序列在人EST数据库中进行搜索得到多条EST序列可以将它们覆盖,推测HDAC7可能为新基因。结论:1.本实验成功利用间歇低氧舱建立了IH状态促进AS形成的实验兔动物模型。IH是加重动脉粥样斑块形成的新的重要危险因素。2.IH状态下AS的发生发展涉及多个基因的改变。差异表达谱分析可能为动脉粥样硬化发病机制研究提供新的思路。3.在IH状态下,血管壁局部的炎症反应合并血液的高凝和脂肪颗粒的沉积可能导致局部动脉粥样斑块的形成;间歇低氧介导有关基质降解的相关调控基因参与了纤维胶原降解与细胞外基质分解过程;间歇低氧可能导致弹性蛋白成熟必需的赖氨酸氧化酶、原纤维蛋白代谢等异常,导致硬化血管壁中多聚糖蛋白能阻碍胶原弹性蛋白聚合到弹性纤维上是其调控影响因素之一,IL-8、COX-2发挥了重要作用。4.在IH状态下肝细胞HDAC7的表达下调,可能通过增强HIF-1α的转录水平活性调控VEGF导致内皮细胞间的不完整性和血管内皮的损伤,为AS的形成提供了基础条件。