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急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS),是重症监护病房(ICU)多器官功能障碍综合征(MODS)中肺部的首要表现,常由创伤、烧伤、感染、休克等多种因素所诱发,病情严重且进展迅速。近年来,众多学者围绕ALI/ARDS的发病机制和防治策略进行了广泛的研究,但仍缺乏快速高效的治疗方案,发病率和死亡率仍居高不下。巨噬细胞是机体免疫防御系统中最重要的细胞之一,其在机体的免疫监视、免疫引发和病原清除中均担任重要角色,可以识别侵入机体的致病原,并诱发免疫反应以达到清除致病原的作用。有研究发现,在急性肺损伤发生发展的过程中,巨噬细胞的大量激活和后期凋亡均与其病理改变有着密切联系。早期在体内外各类病原刺激物的作用下,M1型巨噬细胞大量激活,分泌各类促炎性细胞因子和其他炎症介质,使中性粒细胞大量活化并迁移至炎症部位,促进肺部炎症爆发且导致肺部组织损伤,肺血管通透性增加,产生肺水肿。在肺损伤的晚期,巨噬细胞更多地呈现为M2型,功能主要在于抑制炎症反应,吞噬中性粒细胞,分泌抗炎性细胞因子和介质,促进胶原合成和伤口修复等。但若前述过度激活的炎症反应发生失控,巨噬细胞在促炎和抑炎的过程中功能失衡。吞噬了中性粒细胞的巨噬细胞功能下降,并可发生凋亡或细胞焦亡等形式的程序性死亡,使巨噬细胞数量减少,机体的抗炎功能进一步降低,肺部炎症和组织损伤进一步加重。因此,明确巨噬细胞在急性肺损伤中发生发展中的作用特点和机制,对于探索肺损伤的治疗方案有着重要的启示和作用。在本课题中,首先利用C57BL/6小鼠,培养并获取骨髓源性M2型巨噬细胞,随后进行小鼠体内的干预治疗,观察外源性的M2型巨噬细胞补充对肺损伤小鼠肺部炎症因子、细胞浸润、蛋白渗出、水肿和肺组织病理损伤的影响和规律。最后,根据变化特点,通过体外培养和抗体阻断相结合等方法,进一步探索其所引起变化的可能和潜在机制。第一部分骨髓源性M2型巨噬细胞的培养及鉴定目的用骨髓细胞分化的方法培养出符合实验要求的骨髓源性M2型巨噬细胞。方法1.选取4-5 w的健康雄性野生型C57BL/6小鼠,处死后收集下肢股骨和近端胫骨骨髓腔内的原始骨髓细胞,给予巨噬细胞集落刺激因子M-CSF诱导分化7天后,更换为细胞因子IL-4分化1天,获得骨髓源性M2型巨噬细胞。2.收集培养获得的M2型巨噬细胞,以F4/80抗体和CD206抗体作为标记,经流式细胞术检测培养所得的M2型巨噬细胞的纯度。结果给予M-CSF、IL-4诱导分化原始骨髓细胞,得到M2型巨噬细胞。该细胞生长状态良好,镜下形态满意。经流式检测后M2型巨噬细胞纯度理想,可到90%以上,满足实验要求。结论骨髓源性M2型巨噬细胞培养成功,后续试验可顺利进行。第二部分M2型巨噬细胞对急性肺损伤小鼠肺部的保护作用目的探索M2型巨噬细胞对LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺部炎症反应和病理损伤的影响。方法取6-8w的C57BL/6小鼠按每组6只的方式随机分为3组:假手术(Sham)组,模型(LPS)组和细胞治疗(M2)组。经脂多糖(LPS)诱导ALI模型后3h,M2组小鼠经肺内给予无菌M2型巨噬细胞悬液输注。分别在肺损伤造模后6h、24h处死小鼠,获得肺损伤小鼠的肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)待后续检测。1.流式细胞术进行BALF中性粒细胞和T细胞计数。2.BCA法检测BALF中蛋白浓度。3.ELISA法检测BALF中细胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-10的分泌。4.对小鼠肺组织进行干湿比称重计算。5.将小鼠肺组织做石蜡切片进行HE染色,然后行病理学评分。结果1.在术后6h和24h,M2组小鼠BALF中中性粒细胞较LPS组明显减少;在术后24h,M2组小鼠BALF中T细胞较LPS组增加(P<0.05)。2.在肺损伤后6h和24h,M2组小鼠BALF中蛋白浓度较LPS组明显降低(P<0.05)。3.在6h和24h,M2组较之LPS组,BALF中促炎性细胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β水平均有明显降低,而抑炎性细胞因子IL-10分泌增加(P<0.05)。4.在肺损伤后6h,M2组与LPS组干湿比未无差异;但在术后24h,M2组小鼠肺组织干湿比较LPS组明显降低,证明肺水肿得到缓解(P<0.05)。5.在肺损伤后6h和24h,M2组小鼠肺部的病理损伤均较LPS组均有明显减轻,病理评分显著降低(P<0.05)。结论骨髓源性M2型巨噬细胞对急性肺损伤小鼠的肺部具有保护作用。M2型巨噬细胞可以缓解小鼠肺部病理损伤,降低富蛋白液的渗出,减少中性粒细胞浸润,调节炎性细胞因子的分泌。第三部分M2型巨噬细胞对小鼠肺部保护作用的机制研究目的探讨骨髓源性M2型巨噬细胞对小鼠急性肺损伤保护作用的可能机制。方法1.将培养所得的M0和M2型巨噬细胞进行消化计数后,按照[M0/M2]细胞数[1:10]、[1:1]、[10:1]的不同比例进行混合共培养,给予LPS刺激24h后,收集上清,ELISA检测细胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β和IL-10的表达水平。2.流式细胞术检测M2型巨噬细胞表面PD-L1分子的表达。3.流式细胞术检测M2型巨噬细胞治疗后BALF中T细胞表面PD-1的表达。4.将小鼠随机分为4组:假手术(Sham)组,模型(LPS)组,Isotype抗体(Isotype)组和Anti-PD-L1抗体(Anti-PD-L1)组。经LPS造模后3h,Anti-PD-L1组予Anti-PD-L1抗体肺内滴注后,同时予以M2型巨噬细胞输注。在肺损伤24h处死小鼠收取BALF,检测细胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β和IL-10的浓度。结果1.M0/M2共培养结果显示:伴随着M2型巨噬细胞比例的增加,促炎性细胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β的分泌逐渐降低;同时,M2型巨噬细胞数量的增加同时,抑炎性细胞因子IL-10的分泌也呈现出降低趋势(P<0.05)。2.M2型巨噬细胞表面高表达PD-L1分子,其阳性率达99%±1.8%以上。3.M2型巨噬细胞治疗后BALF中T细胞表面高表达PD-1分子,阳性率达95%±4.1%以上。4.在阻断PD-L1信号再输注M2型巨噬细胞,小鼠肺部炎症因子并未得到降低,反而有升高趋势。阻断PD-L1分子小鼠肺部细胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β分泌增加(P<0.05)。结论M2型巨噬细胞可以调节细胞因子的分泌。M2型巨噬细胞可能并非直接通过IL-10途径发挥抗炎作用的主要机制。M2型巨噬细胞的肺部保护作用可能与PD-1/PDL1信号通路有关。