岩藻多糖降解酶的克隆表达与酶学性质研究

来源 :大连海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liuhu8207
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低分子量的岩藻多糖(LMWF,low molecular weight fucoidan)的应用前景吸引了人们的广泛关注,然而低分子量岩藻多糖的制备及商品化的岩藻多糖降解酶酶制剂的缺乏制约了其在医药、食品、化妆品等领域的大规模应用。海洋微生物是岩藻多糖降解酶的重要来源,筛选岩藻多糖代谢新菌株,对发掘具有潜在产业化价值的岩藻多糖降解酶具有重要意义。自大连长兴岛采集的样品中筛选获得8株能够利用岩藻多糖的菌株。其中菌株2-8发酵液酶活力相对较高(0.15 U/mL)。基于形态观察以及系统生物学分析,菌株2-8被鉴定为蜡样芽胞杆菌,命名为Bacillus cereus 2-8。根据NCBI数据库中岩藻多糖降解酶的信息,以Bacillus cereus 2-8作为研究对象,设计简并引物,通过基因工程技术获得目的基因BcFucA,并将其构建到pET21a质粒上,在大肠杆菌中胞内表达后获得具有6×His标签的重组蛋白质BcFucA,镍柱亲和层析对粗酶进行纯化后获得单一的BcFucA。为了考察BcFucA中linker(Lys261-Thr681)对BcFucA活性的影响,采用RF-Cloning技术进一步获得截短体蛋白质BcFucA△linker。BcFucA长3411 bp,编码1136个氨基酸,理论分子量为125.35 kDa,等电点为5.87。纯化后的BcFucA酶活力为11.655 U,其最适反应温度和pH分别为50℃和4.0,并且在20-50℃及pH为3.0-7.0之间具有良好稳定性;1 mM的Fe3+能够显著促进BcFucA的活性;1 mM的Zn2+能显著抑制BcFucA的活性;通过MALDI-TOF-MS对BcFucA水解岩藻多糖产物分析结果表明,主要产物为一糖、二糖和五糖。截短体蛋白质BcFucA△linker的研究证明了linker对BcFucA活性的重要性。
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