眼表面疾病是眼科常见病，其中许多疾病都存在角膜缘干细胞缺陷或功能障碍，治疗也相当棘手。直到1986年，Schermer等首次证实了角膜干细胞定位于角膜缘基底层的设想。基于角膜缘干细胞的新概念，近10年来眼表面重建研究集中于角膜缘部上皮细胞，成为当今国际眼科研究热点之一。自体角膜缘上皮移植已在临床上广泛开展并获得良好的疗效。然而，由于自体取材很多情况下受限，如双眼同时存在角膜缘干细胞缺陷，同种异体角膜缘上皮移植和以体外培养的角膜缘干细胞移植是最新的研究目标。进而，供体材料的保存也成为人们关注的焦点。超低温(-196℃)冷冻保存法的优势是保存时间长，降低抗原性，保证供体材料随需随取和临床移植手术的计划性，并为组织配型提供时间上的保障。超低温冷冻保存方法已成功地应用于角膜的保存，但保存的关键是维持角膜内皮细胞的活性。那么，该保存方法是否也适合于角膜缘上皮的长期保存呢?适宜的冷冻条件如何?冷冻保存组织复温后，上皮细胞活性和超微结构有无改变?角膜缘干细胞对超低温的耐受性怎样?冷冻是否能诱导干细胞凋亡?有关这些问题，目前国内外文献中尚无报道。 角膜缘干细胞是角膜上皮更新的源泉。迄今，证实该干细胞的存在都是间接证据，尚无直接定性的免疫学和形态学标志。但近年来许多研究表明，体外培养的原代角膜缘上皮细胞属未分化细胞，具有干细胞的特性，因此，在研究中可把原代细胞看作是干细胞。透射电镜下，核大深染、胞浆少和细胞器缺乏的角膜缘基底细胞，被公认为是干细胞。基于以上观点，本研究先从不同冷冻复温条件对角膜缘表层上皮细胞活性的影响人手；再通过原代细胞培养，探讨角膜缘干细胞的冷冻复温后增殖特点；其次通过器官培 养，探讨表皮生长因子对角膜缘全层上皮细胞的增殖活性影响；最后通过超微结构的研究，探讨角膜缘干细胞在冷冻后凋亡情况。通过以上系列体外实验研究，探讨超低温冷冻保存对角膜缘上皮细胞的影响，为今后的进一步实验研究和临床应用提供理论依据。 方 法 论文一： 1．冷冻复温条件的设定：冷冻保护剂选用二甲基亚枫(DMSO)，按照不同浓度和梯度分为5组。降温方法：按照不同的降温速率分为4组，其中3组为程序降温，另1组为非程序降温(直接移人液氮)。复温条件：按照不同的热传导介质和温度分为4组。液氮中(一196℃)保存时间1月～1年。 2．采用台盼蓝和茜素红套染方法，对角膜缘表层上皮细胞的平均存活率(SESR)和形态进行对比研究。 论文二： 1．冷冻条件设定：按照冷冻保护剂浓度和梯度不同，分为3组；按照降温条件不同分为2组；复温条件为37℃水浴。并和新鲜组织同时做对照观察。 2．角膜缘上皮细胞培养：按照培养基中是否加入血清，分为两大组：血清培养法和无血清培养法。每组中，分别对消化培养法和组织块培养法进行对比研究。血清培养法中，对RPMI一1640、MEM、DMEM 3种培养基进行比较；在无血清培养中，对小鼠3T3细胞和小鼠腹腔巨噬细胞2种滋养层进行比较。 3．采用相差显微镜对培养细胞的生长特点和形态做记录和照相观察。 4．若丹明一B染色实验：采用若丹明染色方法对原代细胞的增殖能力进行定量测定。 论文三： 1．冷冻条件设定：1种浓度梯度DMSO，1℃/Min的降温速率，37℃水浴复温。 2．角膜缘上皮组织的器官培养：培养液中加入不同浓度的表皮生长因子(EGF)。 3．角膜缘上皮细胞的增殖核抗原(PCNA)表达：采用SABC免疫组织化学染色法。 论文四： 1．冷冻条件设定：同论文三。 2．器官培养不同时间的角膜缘上皮细胞做透射电镜观察。 3．观察角膜缘上皮基底层和中间层出现凋亡细胞的时间。 结 果 论文一： 1．冷冻保护剂的影响：4种浓度梯度DMSO做冷冻保护剂组的角膜缘表层上皮细胞SESR最高，与其它4组有显著性差异(p<0.01)；无冷冻保护剂组SESR最低。 2．降温方法的影响：程序降温组的角膜缘表层上皮细胞的SESR高于非程序降温，差异有显著性(p<0.01)；程序降温组中，1.0℃/rain、5.0℃/min、10.0℃/min的降温速率的角膜缘表层上皮细胞SESR无显著性差异(p>0.05)。 3．复温方法的影响：60℃和37℃水浴中复温组的角膜缘上皮细胞SESR无显著性差异(p>0.05)，但均高于18℃水浴组和室温空气组(p<0.001)。 4．保存时间的影响：贮存1个月至1年的材料，其SESR无显著性差异(p>0.05)。 论文二： 1．细胞生长特点及形态：程序降温保存的角膜缘上皮细胞易于血清培养中生长，细胞为多边形或不规则形，融合为单层；而在无血清培养基中生长缓慢，细胞为长条形或梭形。消化培养法的冷冻角膜缘上皮细胞，在血清培养和无血清培养基中均不易贴壁生长；而组织块培养法的细胞呈膜状生长，易融合成单层。非程序降温(直接移人液氮)保存的角膜缘上皮亦能贴壁生长，但贴壁时间较晚，细胞大小不一，形态多样。 2．细胞增殖能力： 1)冷冻保护剂的影响：采用1种和4种浓度DMSO冷冻保存的角膜缘 上皮细胞，在无血清培养和血清培养条件下，细胞增殖能力(A值)差异无显著性(p>0.05)；但二组与无DMSO组比较，差异显著(p<0.001)。在无血清培养组中，以3T3细胞为滋养层，细胞增殖能力(A值)与巨噬细胞相似(p>0.05)。在血清培养组，以1640培养基的细胞增殖能力最强，与MEM组和DMEM组比较，其A值差异显著(p<0.05)。在相同的冷冻条件下，血清培养组细胞增殖能力(A值)显著高于无血清培养组(p<0.05，P<0.01)。 2)冷冻速率的影响：采用1℃/min的冷冻速率降温与直接移人液氮比较，角膜缘上皮细胞在无血清培养和血清培养条件下，细胞增殖能力(A值)差异无显著性(p>0.05)。在无血清培养组中，3T3细胞做滋养层的细胞增殖能力(A值)与巨噬细胞相似(p>0.05)。在血清培养组，仍以1640培养基的细胞增殖能力最强，与MEM组和DMEM组比较，其A值差异显著(p<0.05)。在相同的冷冻条件下，血清培养组细胞增殖能力(A值)显著高于无血清培养组(p<0.05，P<0.01)。 3)冷冻与新鲜组织的比较：在血清培养条件下，两组的细胞增殖能力差异无显著性(p>0.05)；但在无血清培养基中，冷冻组织的细胞增殖能力明显低于新鲜组织(p<0.01)。 论文三： 各组角膜缘上皮细胞核中均可见PCNA表达，染色呈棕黄色或棕褐色，染色阳性细胞主要在基底细胞层，但EGF组染色较深，中间细胞层可见较多的阳性细胞。EGF组的PCNA染色阳性率显著高于无EGF组(p<0.01)；而不同浓度的EGF组之间阳性率无显著差异(p>0.05)。 论文四： 超低温保存的人与兔角膜缘上皮细胞超微结构变化相似。角膜缘上皮仍呈复层结构。器官培养第20天，角膜缘中间层和基底层上皮细胞只见细胞轮廓，细胞问桥粒尚可见；核溶解坏死；有的细胞核内可见凋亡小体。 结 论 1．角膜缘上皮组织适合采用超低温冷冻法保存；其活性不受降温速率和贮存时间的影响；因此保存方法简便。 2.角膜缘干细胞对超低温的耐受性显著强于表层分化的上皮细胞。 3．超低温保存的角膜缘干细胞增殖，比新鲜组织更具有血清依赖性。 4．消化培养法不适于冷冻角膜缘上皮细胞培养，组织块培养法是值得推的方法。 5．在兔角膜缘上皮细胞的含血清培养中，RPMI一1640为优选培养基。 6.在无血清培养中，可用小鼠腹腔巨噬细胞代替3T3细胞作为滋养层，简化培养过程。 7.在器官培养中，EGF能上调超低温冷冻保存的角膜缘上皮细胞PC-NA的表达；但无量效依赖性。 8.超低温冷冻保存的角膜缘上皮细胞超微结构基本完整。 9.超低温冷冻保存可能诱导角膜缘干细胞凋亡。