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磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)是一种具有保健与医药功能的重要磷脂。但其含量在天然磷脂中非常低,而从豆油渣中分离而得的大豆卵磷脂(phosphatidylcholine,PC)是一种含量丰富的磷脂,利用磷脂酶D(phospholipaseD,PLD)可以催化PC转化成PS,是制备PS较为理想的方法。 本研究从Streptomyces racemochromogenesATCC23954发酵液中获得了高活性的PLD。首先对产酶条件进行了初步的研究与优化,研究发现在培养基中添加2.5 g/L大豆卵磷脂(60%,w/w)可以提高产酶,单位产酶量最高达到0.7 U/mL左右。其次对酶液进行初步纯化获得粗酶用于研究基本酶学性质,结果发现酶反应最适温度为50℃,在30℃条件下酶活较低,但酶稳定性最佳,温育8h残余活性91.5%;最适pH为8,在常温下pH7.5保存6h残余活性仍有89%,此时稳定性最高;在催化反应中添加10 mMMg2+可以使酶活提高1.3倍。在获得高活性PLD的基础上,建立了双相催化体系产PS,并通过研究双相体系的反应条件,考察PLD双相催化能力。结果表明,热稳定性更好的醋酸丁酯被用作有机相溶剂,在pH5.5、50℃,L-丝氨酸与PC摩尔浓度比100∶1的条件下,催化20 mM PC,转酯率达到最高90%(mol/mol)。另外,通过对双相催化体系的动力学研究获得了双相体系的基本特性,结果表明,PC浓度与初始转酯反应速率的关系符合米氏动力学方程,其中Vmax=1.71 mM·min-1,Km=0.13 mM;高浓度L-丝氨酸与初始转酯反应速率的关系符合米氏动力学方程,其中Vmax=3.89 mM·min-1,Km=1548.5 mM。 本研究创新性地建立了PLD微水相催化体系,该催化体系有别于已报道的所有PS酶法制备体系,通过L-丝氨酸和微量水包裹酶成功实现了高效转酯反应。通过研究,在水含量6.25%、酶量0.17 U/mL,L-丝氨酸与大豆磷脂(PC)摩尔浓度比20∶1的条件下,催化20 mM PC,6h转酯率可达到88%(mol/mol),且未发现水解反应的发生。与已报道的双相催化体系相比,本研究体系完全抑制了水解反应。同时,在该体系研究的基础上,首次利用盐析处理PLD,使得其可以在微水相中循环使用三次仍能保持70%(mol/mol)左右的转酯率,实现了PLD的高效重复利用。